本发明专利技术提供了一种大肠杆菌Escherichia coli Nissle 1917的发酵培养方法。在发酵过程初期控制葡萄糖流加量，后期采用蔗糖作为碳源的补充，降低了发酵后期抑制菌体生长乙酸的积累量，同时与优化的培养基和发酵条件相配合提高了活菌体数量，且批次间重复性稳定，有利于生产化工业控制。本发明专利技术还提供了以上述发酵培养方法所得大肠杆菌EcN为原料的饲料添加剂的制备方法，将赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苏氨酸、甜味料和大肠杆菌EcN与水加热混匀后，得到饲料添加剂；通过各原料之间的协同作用，使得制得的饲料添加剂中的营养成分均匀，使用效果好，同时用于制备该添加剂的方法简单、原料易得。
【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌的发酵培养方法及其在饲料添加剂中的应用
本专利技术具体涉及一种大肠杆菌的发酵培养方法及其在饲料添加剂中的应用。本专利技术属于生物
技术介绍
大肠杆菌Nissle1917(EscherichiacoliNissle1917，EcN)是由德国科学家AlfredNissle于1917年分离出的一种优质益生菌，它具有多种优良性能，如改善肠道微生物群落，抑制病原菌生长，不含肠毒素等对人体致病的有害因子，对肿瘤具有高靶向性。研究发现EcN对常见胃肠道疾病有良好疗效，被广泛用于预防传染性腹泻、溃疡性结肠炎等炎性肠疾病，防止新生儿消化道内病原菌定殖等。目前该细菌作为益生菌，在德国、美国等地已广泛用于临床，主要用于治疗腹泻，同时也越来越多的作为疫苗，疾病诊断和抗肿瘤药物研发，这些研究的开展将使人类从EcN中获益更多。目前在动物营养领域，有关EcN的研究并不多。众所周知，仔猪肠道发育不完善和肠道微生态区系复杂，断奶应激会损伤肠道黏膜，因此如何调控肠道健康已成为仔猪生长发育的关键。目前断奶仔猪腹泻率很高，在很大程度上影响了仔猪的生长性能，在治疗过程中，大量使用抗生素，造成了资源的浪费和药物的滥用，已有研究报道，口服益生菌EcN能显著降低断奶仔腹猪泻率和竞争性阻碍沙门氏菌入侵，同时能有效预防产毒素大肠杆菌的感染，降低断奶仔猪腹泻率，从而提高断奶仔猪的生长性能，起到部分替代抗生素的作用。但是目前将EcN作为饲料添加剂应用到动物营养中的相关报道尚未有发现。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种大肠杆菌的发酵培养方法及其在饲料添加剂中的应用。为实现上述目的，采用下述技术方案。一种大肠杆菌(EscherichiacoliNissle1917，EcN)的发酵培养方法，包括以下步骤：(1)菌种活化：将菌保管从-80℃超低温冷冻存储箱取出，待其解冻后吸取少量菌液划线于LB平板上，倒置于37℃恒温箱内过夜培养；(2)摇瓶种子培养：挑取平板上的单菌落于LB液体培养基中，37℃培养4～5小时，摇床转速200rpm，OD600值为1.5～2.0；(3)发酵培养：将摇瓶种子液移入装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，接种量为0.67％(每100mLKB培养基加入0.67mL种子液)，培养周期为16小时，OD600为42，湿重6.08g/100ml，干重2.125g/100ml，活细胞数5.67×1013CFU/mL；在发酵初期3小时、5小时分别流加占培养基体积分数2％的混合流加液Ⅰ，7小时、9小时、11小时、15小时分别流加占培养基体积分数2％的混合流加液Ⅱ。优选的，步骤(2)所述LB培养基的各组分质量百分比为酵母浸粉0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，其余为水。优选的，步骤(3)所述发酵培养基的各组分质量百分比为葡萄糖1％，硫酸铵2.5％，玉米浆粉0.5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸亚铁0.05％，碳酸钙1％，其余为水。优选的，步骤(3)所述发酵培养的培养条件为：pH为6.9～7.1，罐压为0.05Mpa，通气量1.5～2.4m3/h，溶氧0.075mmol/L以上，初始转速300rpm。优选的，步骤(3)所述混合流加液I中葡萄糖的质量分数为50％，磷酸氢二胺的质量分数为7.5％。优选的，步骤(3)所述混合流加液II中蔗糖的质量分数为50％，磷酸氢二胺的质量分数为7.5％。一种大肠杆菌Nissle1917动物饲料添加剂，包括赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苏氨酸、甜味料、大肠杆菌Nissle1917和水，所述各种成分按重量百分比计算所占比例为：赖氨酸盐酸盐20％～25％，蛋氨酸4％～8％，苏氨酸4％～8％，甜味料4％～8％，大肠杆菌Nissle1917为4％～8％，其余为水。优选的，所述动物饲料添加剂的制备方法为：将赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苏氨酸、甜味料和大肠杆菌EcN与水按配方比混合，加热混匀后，得到饲料添加剂。进一步优选的，所述加热温度为45～55℃；加热时间为5～10分钟。本专利技术的有益效果：1、采用本专利技术的发酵培养方法培养的大肠杆菌EcN接种量能尽量延长对数期，使菌体大量增殖，获得更多的活细胞。2、本专利技术的发酵培养方法培养在发酵培养过程中采用流加方式避免了菌体发酵后期乙酸大量积累的现象，从而保证菌体在生长过程中不遭受乙酸的抑制作用。3、本专利技术获得一种经济又简单的发酵培养基，可在进行大批量发酵的同时节约经济成本，有利于工业化生产。4、以大肠杆菌EcN为主要原料制备饲料添加剂，通过各原料之间的协同作用，使得制得的饲料添加剂中的营养成分均匀，使用效果好，同时用于制备该添加剂的方法简单、原料易得。附图说明图1为EcN扩大发酵培养的生长曲线；图2为EcN对断奶仔猪腹泻率的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例1：大肠杆菌(EscherichiacoliNissle1917，EcN)的发酵培养方法菌种活化：将菌保管从-80℃超低温冷冻存储箱取出，待其解冻后使用1μl接种环沾取少量菌液划线于LB平板上，倒置于37℃恒温箱内过夜培养，LB固体培养基各组分质量百分比为：酵母浸粉0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，1.5％琼脂，其余为水。摇瓶种子培养：在超净工作台内用1μl接种环挑取LB平板上活化好的单菌落于盛装LB液体培养基的摇瓶中，装瓶量为500ml的瓶体装液100ml培养基，37℃培养4小时，摇床转速200rpm，OD600值大约为2.0。LB液体培养基：酵母浸粉0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，其余为水。发酵培养：将摇瓶种子液接入含有发酵培养基的发酵罐中，接种量为0.67％，即：每100mLKB培养基加入0.67mL种子液。发酵罐的设定条件为pH为7.0，罐压0.05Mpa，通气量2m3/h，初始转速300rpm，转速与溶氧量级联，发酵过程中通过逐渐提高转速而保证罐中溶氧不低于30％(0.075mmol/L以上)。发酵培养基各组分质量百分比为：葡萄糖1％，硫酸铵2.5％，玉米浆粉0.5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸亚铁0.05％，碳酸钙1％，其余为水。发酵初期控制糖浓为0.8％，使菌体获得足够碳源，虽然菌体对葡萄糖的利用率高于对蔗糖的利用率，但又需克服菌体在利用葡萄糖的过程中会产生乙酸问题，最终采用的流加工艺为在发酵初期3h、5h分别流加占培养基体积分数2％的混合流加液Ⅰ，混合流加液Ⅰ中磷酸氢二铵的质量分数为7.5％，葡萄糖的质量分数为50％，7h、9h、11h、15h分别流加占培养基体积分数2％的混合流加液Ⅱ，混合流加液Ⅱ中磷酸氢二铵的质量分数为7.5％，蔗糖的质量分数为50％。按上述方法大肠杆菌(EscherichiacoliNissle1917，EcN)的扩大发酵培养的生长曲线如图1所示。结果表明：改变流加方式不仅很好解决了产生乙酸的问题，而且在流加液中添加无机氮源，取得一举两得的效果，一方面能够提高微生物对氮源的利用效率，另一方面菌体代谢氮源产生的碱与代谢碳源产生的酸进行中和，能够更好的控制pH。实施例2：大肠杆菌EcN在动物营养中的应用1.材料：从中国兽医药品监察所选购3种导致仔猪下痢的大肠杆菌典型病原菌株，其血清型分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大肠杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化：将菌保管从‑80℃超低温冷冻存储箱取出，待其解冻后吸取少量大肠杆菌Nissle 1917菌液划线于LB平板上，倒置于37℃恒温箱内过夜培养；(2)摇瓶种子培养：挑取平板上的单菌落于LB液体培养基中，37℃培养4～5小时，摇床转速200rpm，OD600值为1.5～2.0；(3)发酵培养：将摇瓶种子液移入装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，接种量为0.67％，培养周期为16小时，OD600为42，湿重6.08g/100mL，干重2.125g/100mL，活细胞数5.67×10
【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化：将菌保管从-80℃超低温冷冻存储箱取出，待其解冻后吸取少量大肠杆菌Nissle1917菌液划线于LB平板上，倒置于37℃恒温箱内过夜培养；(2)摇瓶种子培养：挑取平板上的单菌落于LB液体培养基中，37℃培养4～5小时，摇床转速200rpm，OD600值为1.5～2.0；(3)发酵培养：将摇瓶种子液移入装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，接种量为0.67％，培养周期为16小时，OD600为42，湿重6.08g/100mL，干重2.125g/100mL，活细胞数5.67×1013CFU/mL；在发酵初期3小时、5小时分别流加占培养基体积分数2％的混合流加液Ⅰ，7小时、9小时、11小时、15小时分别流加占培养基体积分数2％的混合流加液Ⅱ。2.根据权利要求1所述一种大肠杆菌的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)所述LB培养基的各组分质量百分比为：酵母浸粉0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，其余为水。3.根据权利要求1所述一种大肠杆菌的发酵培养方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵培养基的各组分质量百分比为：葡萄糖1％，硫酸铵2.5％，玉米浆粉0.5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸亚铁0.05％，碳酸钙1％，其余为水。4.根据权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：涂强，张友明，印遇龙，于芳楠，潘登，刘峰，尹佳，刘晨浪，
申请(专利权)人：山东大学，德州迈科生物技术有限公司，湖南师范大学，山东亿安生物工程有限公司，禹城保立康生物饲料有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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