甲氧苄啶类药物半抗原、检测甲氧苄啶类药物的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能识别多种甲氧苄啶类药物的广谱单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株TMP/2G1所分泌的，所述的杂交瘤细胞株TMP/2G1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201783。本发明专利技术还公开了检测牛奶、蜂蜜和动物可食性组织中甲氧苄啶类药物残留的酶联免疫方法及其试剂盒。本发明专利技术制备的单克隆抗体灵敏度较高，广谱性强，检测的准确度高，精密度好，具有简便、快速、易操作等优点。

【技术实现步骤摘要】
甲氧苄啶类药物半抗原、检测甲氧苄啶类药物的单克隆抗体及其应用
本专利技术属于兽药残留分析和免疫学
，具体涉及一种能识别甲氧苄啶类药物的广谱单克隆抗体，本专利技术还涉及用于制备该单抗的半抗原以及用于检测甲氧苄啶类药物的酶联免疫方法(ELISA)与试剂盒。
技术介绍
甲氧苄啶类药物主要用作增强抗生素的抗菌作用，因此也称作抗菌增效剂。这类药物主要包括甲氧苄啶(TMP)、二甲氧苄啶(DVD)、奥美普林(OMP)、巴喹普林(BQP)、溴莫普林(BMP)，此外还有正处于研发状态的艾地普林(ADP)。其中DVD、BQP、OMP为动物专用抗菌药，主要是与磺胺药共同用于各种疾病的治疗。TMP在兽医和人医方面的应用均非常广泛，与其它药物联合应用可以预防和治疗各种细菌疾病的感染。BMP在人医上应用较为广泛。这些药物有许多不良反应，例如对造血系统有负面影响。许多国家和组织制定了该类药物最高残留限量。中国和欧盟规定TMP在动物可食性组织中的最高残留限量为50μg/kg，BQP在牛、猪各靶组织的最高残留限量为10-300μg/kg；加拿大规定OMP在大马哈鱼可食性组织的最高残留限量为100μg/kg；日本规定DVD在鸡可食性组织的最高残留限量为50μg/kg。用于检测甲氧苄啶类药物的方法主要有仪器分析法和免疫学检测方法。仪器分析法的灵敏度、准确度、精密度较高，可同时对多种甲氧苄啶类药物进行定性，定量研究，且检测限已达到μg/kg或μg/L水平。但该类方法需要昂贵的仪器设备，样品前处理较为复杂，对操作人员的技术要求较高，且只适用于实验室研究而不适用于高通量样品的筛选。用于检测甲氧苄啶类药物的免疫学方法主要包括胶体金免疫层析法(GICA)和酶联免疫吸附法(ELISA)。其中ELISA方法具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高且可进行半定量检测等优点，非常适合现场的高通量样品检测。CN104370829A公开了一种甲氧苄啶半抗原，它是将甲氧苄啶2位上的氨基连接上丁二酸，与载体蛋白偶联后用于制备检测甲氧苄啶的多克隆抗体或单克隆抗体，检测限为0.47ng/mL，各类似物的交叉反应率均小于5％。CN105652004A公开了另一种甲氧苄啶半抗原，它是在甲氧苄啶的4位甲氧基上连接上丙酸，与载体蛋白偶联后用于制备检测甲氧苄啶的单克隆抗体，灵敏度可达2ppb，与其它常见磺胺类药物均无交叉反应。目前检测甲氧苄啶类药物的ELISA方法只能检测TMP一种药物，几乎没有关于这类药物的多残留ELISA检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有抗体仅能检测一种甲氧苄啶类药物的缺陷，提供一种能同时检测多种甲氧苄啶类药物的单克隆抗体和ELISA方法及试剂盒，本专利技术还提供一种用于制备单克隆抗体的半抗原。上述目的是通过以下技术方案实现的：一种甲氧苄啶类药物半抗原，其结构式如式(1)所示：该半抗原是将二甲氧苄啶经过一系列的反应，将4位上的甲基取代为丁酸。所述半抗原与载体蛋白偶联后作为免疫原，免疫动物后经细胞融合，得到杂交瘤细胞株TMP/2G1，并采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体。所述的杂交瘤细胞株TMP/2G1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201783。所述载体蛋白优选牛血清白蛋白(BSA)。一种单克隆抗体，能识别甲氧苄啶类药物，它是杂交瘤细胞株TMP/2G1所分泌的。所述的单克隆抗体用于制备检测甲氧苄啶类药物的试剂盒。所述的试剂盒是检测甲氧苄啶类药物的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒在甲氧苄啶类药物非诊断目的检测中的应用。一种甲氧苄啶类药物非诊断目的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：(1)将二甲氧苄啶为原料经过一系列反应合成式(1)所示的半抗原，然后将半抗原与牛血清白蛋白偶联后得到免疫原；(2)将半抗原与鸡卵清白蛋白偶联后得到包被原；(3)用步骤(1)得到的免疫原制备保藏号为CCTCCNO:C201783的杂交瘤细胞株TMP/2G1；(4)用杂交瘤细胞株TMP/2G1制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)得到的包被原包被固相载体；(6)样品的处理与检测。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术在制备单克隆抗体时，以式(1)所示的化合物作为半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联作为免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗体能同时识别甲氧苄啶、二甲氧苄啶、艾地普林、巴喹普林、奥美普林、溴莫普林多种抗菌增效剂；(2)本专利技术的酶联免疫方法和试剂盒适用于检测牛奶、蜂蜜、动物可食性组织、中多种甲氧苄啶类药物的残留，检测的灵敏度、准确度高，精密度好，甲氧苄啶、二甲氧苄啶、艾地普林、巴喹普林、奥美普林、溴莫普林的IC50值分别为0.232、0.527、1.479、4.354、0.965和0.119μg/L；(3)本专利技术所涉及的检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者要求低，身体健康危害相对较小。附图说明图1是半抗原的MASS质谱图。图2为本专利技术的单克隆抗体与甲氧苄啶类药物标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为甲氧苄啶标准溶液浓度的对数值，Y轴为甲氧苄啶药物标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明，但不限制本专利技术。实施例1免疫原和包被原的制备1.1半抗原DVDCOOH的制备①称取10gDVD，70mL48％HBr溶液置于250mL的圆底烧瓶中，在100℃油浴条件下回流反应30min。加入50mL50％的氢氧化钠，室温下静置过夜，会有大量的白色固体析出。抽滤，将固体溶于沸水中，并用氢氧化铵调节溶液为中性，在冰浴条件下重结晶析出白色晶体。②称取白色晶体4.5g，20mL二甲基甲酰胺(DMF)，钠氢1.5g，4-溴丁酸乙酯10g置于50ml圆底烧瓶中,室温下反应12h。加入400mL水和20mL正丁醇以及80mL乙酸乙酯，如此反复萃取3次，收集有机相。50℃旋蒸有机溶剂，最后得到黄褐色油状物。以二氯甲烷：甲醇＝10:1作为展开剂过柱子纯化产物，最后得到2.3g白色固体。③称取产物2g，18mL甲醇，2mL10％氢氧化钠溶液置于50mL圆底烧瓶中，55℃反应1h，用稀盐酸调溶液PH为4～5，在冰浴条件下会有白色晶体析出即为半抗原DVDCOOH。经质谱鉴定，在正离子模式轰击下，[M+H]+的理论值为333.1557，测定值为333.1573(见图1)。1.2完全抗原DVDCOOH-DCC-BSA/OVA的制备称取10mgDVDCOOH溶于800μL的DMF,然后加入7mg二环己基碳二亚胺(DCC)，14mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，常温活化11h，在冰浴条件下加入7mLPBS溶解的BSA25mg，冰浴条件下避光反应8h。将反应液转入透析袋中，4℃PBS中透析5d，每天更换三次透析液，透析后，8000r/min离心10min，保留上清，即得DVDCOOH-DCC-BSA，于-20℃保存备用。同理，将BSA换OVA即得包被原DVDCOOH-DCC-OVA。实施例2单克隆抗体的制备2.1动物免疫利用专利技术人制备的免疫原免疫雌性Balb/C小鼠，免疫剂量分别为每只小鼠50、100、150μg，每种剂量组免疫4只小鼠。免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲氧苄啶类药物半抗原，其结构式如式(1)所示：

【技术特征摘要】
1.一种甲氧苄啶类药物半抗原，其结构式如式(1)所示：2.权利要求1所述的半抗原在制备检测甲氧苄啶类药物的单克隆抗体中的应用。3.一种检测甲氧苄啶类药物的单克隆抗体，其特征在于：它是将权利要求1所述的半抗原与载体蛋白偶联后作为免疫原，免疫动物后经细胞融合，得到杂交瘤细胞株TMP/2G1，并采用体内诱生腹水法制备得到。4.权利要求3中所述的杂交瘤细胞株TMP/2G1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201783。5.权利要求3所述的单克隆抗体在制备检测甲氧苄啶类药物的试剂盒中的应用。6.包...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭大鹏，袁宗辉，韩肖亚，潘源虎，王玉莲，陈冬梅，刘振利，董国良，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42