一种禽流感H9亚型病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于动物传染病检测技术领域，具体涉及一种禽流感H9亚型病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用。本发明专利技术可对禽流感H9亚型病毒抗体进行实时、快速动态定量检测，本发明专利技术的试剂盒由试纸条、测试卡壳和样品稀释液组成，所述的试纸条由样品垫、吸收垫、涂覆有由保藏号为CCTCC M 2017470的大肠杆菌BL21/pSmart‑H9‑HA表达的HA蛋白‑胶体金标记物、兔IgG－胶体金标记物的结合垫，包被有禽流感H9亚型抗原蛋白HA的第一检测线和第二检测线，包被有羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜，依次按吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫的顺序粘贴在不吸水的支撑薄片上构成试纸条。

【技术实现步骤摘要】
一种禽流感H9亚型病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用
本专利技术属于动物免疫应用
具体涉及一种禽流感H9亚型病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用。本专利技术的试剂盒可对禽流感H9亚型病毒抗体进行实时、快速的动态定量检测，对鸡群健康水平、免疫后的抗体水平监测具有重要意义。
技术介绍
禽流感H9亚型(Avianinfluenza，AI)病毒属于低致病性禽流感病毒，在临床上并不能像H5与H7高致病性禽流感病毒那样导致鸡的大批死亡。但是H9亚型禽流感感染却可以引起鸡的免疫抑制，进而导致疫苗的免疫失败或者其它病原的继发感染，是目前危害我国养禽业的主要病原之一，可导致禽不同程度的死亡和生产性能的下降，给我国养禽业造成极大的经济损失。为了避免家禽疾病的发生，疫苗免疫是有效的预防手段，但是免疫后的家禽群体的抗体监测更是不可或缺的，是评价免疫效果，掌握疫情动态最直接、最有效的方法，因此，免疫后的抗体水平监测已成为各地养禽场和诊断室的常规监测项目。现在家禽抗体检测的方法众多，除传统的沉淀反应、凝集实验、补体结合实验外，标记免疫测定技术如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等已成为主要的免疫测定技术，免疫印迹法也发挥了明显的作用，一些快速检测方法如快速斑点免疫结合实验也被广泛使用不同的检测方法，但是其灵敏度、准确性、重复性并不完全相同，加上试剂盒质量不一，都影响到实验结果。在应用或建立一个方法时，检测系统中所有成分的浓度必须经过严格的滴定，选择最恰当的浓度范围。但这些方法对操作人员、设备等有较高的要求。而且上述方法大多耗时较长(如血凝抑制试验需1～2小时；ELISA试验需2～3小时等)，不便于实时、快速诊断，所以均无法在基层大范围地推广使用。胶体金免疫层析(Gold-immunochromatographyassayGICA)是以胶体金作为示踪物，基于胶体金标记技术应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术。其核心技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，因毛细管作用而促使样品溶液在层析条上泳动，并使样品中的待检物与层析膜上针对待检物的受体(如抗原或抗体)在短时间内发生高特异性、高亲和性的免疫反应。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。基于该技术，国内外在人医疾病监测，环境危害监控，食品安全保障及畜禽疾病检测等领域，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测测试卡。在鸡疫病诊断和检测方面，鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊及鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒获得相关专利(专利号：200710169103.0；200710169105.X；200710169104.5；200710169106.4)。但是上述试剂盒是仅对相关疾病或疫苗免疫后抗体水平的进行定性或者半定量检测，不能定量地监测鸡群抗体水平。定量检测鸡群的免疫水平和评价鸡群的免疫状况对于疾病的控制有着重要的意义。本专利技术将禽流感H9亚型病毒蛋白(AIVH9-HA)作为检测线上的捕获试剂，研制出禽流感H9亚型病毒抗体免疫胶体金快速检测试纸条，并与胶体金生物传感检测仪有机整合，建立一种禽流感H9亚型病毒抗体快速定量检测试剂盒。本专利技术还提供了一种监测鸡群AIVH9亚型抗体水平及评估该疾病免疫效果的快速、易用的抗体定量检测方法。本专利技术制备的试剂盒通过双检测线和质控线的信号比值与被检测血清效价(即抗体含量)所呈现的对应关系，实现了实时、定量检测待测血清的效价。为防控禽流感H9亚型的发生提供一种科学有效的技术支撑，同时也为其他疾病抗体的快速、定量监测提供了一种参考依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有胶体金快速检测技术只能进行定性检测或半定量检测的缺陷，提供一种适用于禽流感H9亚型病毒抗体检测的快速定量检测试剂盒及应用，本专利技术的试剂盒特异性强、灵敏度高、操作简单、耗时短，能对禽流感H9亚型病毒抗体水平进行定量检测。本专利技术的应用能减少由人为眼观判定引起的错误率，既提高了检测的时效，又提升了检测结果的客观性、准确性。本专利技术还涉及重组载体pSmart-H9-HA的构建及其开发利用。图1是本专利技术的技术路线图。本专利技术通过以下技术方案实现：申请人筛选得到一种禽流感H9亚型病毒抗体的抗原蛋白，其蛋白质的序列如序列表SEQIDNO：2所示。申请人将上述重组蛋白抗原HA构建到的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pSmart-H9-HA中，得到一种重组蛋白抗原HA的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pSmart-H9-HA，申请人将该重组大肠杆菌命名为大肠杆菌BL21/pSmart-H9-HA，EscherichiacoliBL21/pSmart-H9-HA，于2017年09月05日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2017470。申请人通过制备，得到一种检测禽流感H9亚型病毒抗体的试纸条，该试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，PVC背衬和测试卡壳；在PVC背衬(9)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、第一金标垫(2)，第二金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)；将试纸条装入测试卡壳中构成测试卡；所述的金标垫(3)上包被有胶体金与序列表SEQIDNO：2所示的蛋白序列的重组蛋白抗原HA的胶体金标记物(所述的重组蛋白抗原HA的溶液中含有AIVH9-HA－胶体金标记物)；在所述的硝酸纤维素膜(4)上包被有重组蛋白抗原HA构成的第一检测线(6)，又称T1)和第二检测线(7，又称T2)，以及含有羊抗兔IgG的质控线(8，又称C线)。本专利技术的重组蛋白抗原HA可以应用于制备禽流感H9亚型病毒抗体定量检测试纸条中。本专利技术的试纸条可以应用于在体外检测禽流感H9亚型病毒抗体定量分析中。申请人提供一种适用于非诊断目的的禽流感H9亚型病毒抗体的在体外快速、定量检测的方法，具体步骤如下：1)鸡禽流感H9亚型病毒重组血凝素HA蛋白(简称AIVH9-HA)的表达制备。通过对禽流感H9亚型病毒HA基因的序列克隆，连接相应载体构建重组蛋白表达载体pSmart-H9-HA；2)AIVH9-HA蛋白的纯化，包涵体的纯化与复性，得到抗原(AIVH9-HA)；3)用柠檬酸三钠与氯金酸(购自sigma公司)反应制备胶体金；4)将步骤2)制备的抗原(AIVH9-HA)，与兔IgG分别加入步骤3)制备的胶体金中，得到两种胶体金标记物(AIVH9-HA-胶体金和兔IgG-胶体金)；5)将两种胶体金标记物(兔IgG-胶体金和AIVH9-HA-胶体金)分别包被在第一金标垫(2)和第二金标垫(3)上；6)将步骤2)制备的抗原(AIVH9-HA)包被在硝酸纤维素膜(4)上分别构成第一检测线(6)，即为T1；第二检测线(7)，即T2；并将羊抗兔IgG包被在硝酸纤维素膜(4)上构成质控线(8)；7)在所述的PVC背衬(9)上按顺序依次粘附所述的样品垫(1)、第一金标垫(2)、第二金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸收垫(5)，得到检测禽流感H9亚型病毒抗体胶体金试纸条。8)将步骤7)中所述试纸条装入测试卡壳(10)中构成测试卡。本专利技术的原理是采用双抗原夹心法，金标垫上包被有金标混合物，硝酸纤维素膜上包被有禽流感H9亚型病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达重组蛋白抗原HA的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pSmart‑H9‑HA，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017470。

【技术特征摘要】
1.一种表达重组蛋白抗原HA的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pSmart-H9-HA，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2017470。2.一种检测禽流感H9亚型病毒抗体的试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，PVC背衬和测试卡壳，其特征在于：在PVC背衬(9)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、第一金标垫(2)，第二金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)；将试纸条装入测试卡壳(...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜亮，杨帆，毕丁仁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42