胃癌外泌体miRNA分子标记的应用及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了胃癌外泌体miRNA分子标记的应用及其试剂盒，开发出基于PCR平台miRNA的两步法检测试剂盒，本发明专利技术利用外泌体miRNA为胃癌诊断方面提供了一定的应用价值，为胃癌的诊断和预后提供有利的技术支持。

Application of miRNA marker for exocrine gastric cancer and its kit

The invention discloses the application of the miRNA molecular marker of gastric cancer exocrine and its kit, and develops a two step detection kit based on the PCR platform miRNA. The invention provides a certain application value for the diagnosis of gastric cancer by using exo secretory miRNA, and provides favorable technical support for the diagnosis and prognosis of gastric cancer.

【技术实现步骤摘要】
胃癌外泌体miRNA分子标记的应用及其试剂盒
本专利技术属于医学分子生物学
，具体涉及胃癌外泌体miRNA分子标记的应用及其试剂盒。
技术介绍
根据国际癌症研究机构的统计数据，全球范围内，胃癌发病率位于恶性肿瘤第5位、死亡率居第3位。在我国，胃癌发病率及死亡率均居恶性肿瘤前列。胃癌的病因迄今未阐明，但已认识到多种因素会影响，共同参与胃癌的发生。胃癌癌症早期几乎不会有症状，以消瘦为最多，次为胃区疼痛，食欲不振，呕吐等，初诊时患者多已属晚期，五年生存率低于30％。但如果早期得到诊治，五年生存率可望达到90％。早期检出胃癌能明显有助于提高存活率。然而，由于已经诊断为处于相同阶段的胃癌根据患者的不同而显示出了预后的差异，因此精确预测胃癌预后以及早期检出胃癌是有效治疗胃癌的最重要因素。临床上，已经使用解剖观察法(癌细胞侵入程度和转移的淋巴结数目)以便预测胃癌患者的预后，但是该方法存在医师主观判断的可能介入和精确预测预后的局限。根据传统的治疗方案，一部分早期患者可能能够从术后辅助化疗中获益，而相反，有些低复发风险的进展期患者可能接受了原本不必要的辅助化疗，并为此接受化疗的毒性和风险带来的生活质量下降。因此探寻胃癌诊断标志物对于胃癌的早期诊断，疗效监测，复发及预后判断显得尤为重要。外泌体(Exosome)是一种直径为30-150纳米的囊泡状结构，广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液等生物体液中。它形成于多种细胞，如树突状细胞、肿瘤细胞等的胞吐作用。外泌体的外膜为脂质双层结构，其内包裹有特异的蛋白、信使RNA和非编码RNA等。外泌体中的非编码RNA以miRNA为主，且种类丰富，其可以影响干细胞分化、器官形成、造血作用、肿瘤发生以及新陈代谢等诸多生理活动。miRNA(microRNA)是广泛存在于生物体内的19-25nt的非编码单链小分子RNA，其通过与靶基因mRNA的互补配对降解靶mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗与诊断的新途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列(3′-UTR或5′-UTR)存在着一对多的关系。在癌症病例中经常发现miRNA群表达失调的现象，而这些miRNA表达的改变与癌症发生密切相关。在体外实验中，改变一个或者多个miRNA的表达能够促进或者抑制癌细胞恶化，促进癌细胞恶化的miRNA可以认为是一类癌基因，反之，抑癌基因。外泌体中的miRNA能以稳定的形式存在于人类的体液如血清、血浆中而不被降解，通过特定的分离纯化手段能够被检测到，而且外泌体中生物活性物质可分析活细胞的动态变化，允许实时捕获肿瘤异质性，这也使它有可能成为无创检测筛查的新型重要标志物。
技术实现思路
：本专利技术结合外泌体(exosome)和miRNA的相关特点，对胃癌血清exo-miRNA、肺癌组织exo-miRNA表达图谱的变化及与肿瘤的相关性进行评价，筛选出诊断和预示胃癌外泌体microRNA分子标志物：本专利技术中，所述胃癌外泌体miRNA分子为miR-106a、miR-375、miR-148a或Let-7a中至少两种。进一步，所述标志物为miR-106a与miR-375联合，miR-106a与miR-148a联合或miR-106a与Let-7a联合。进一步，所述诊断和预示为胃癌筛查、辅助诊断、疗效评价、预后评估或复发监控。本专利技术中，所述胃癌外泌体来源于体液或细胞。本专利技术中，所述体液包括血液、痰液、胃液、胃部灌洗液、尿液或唾液中的至少一种。本专利技术还公开了一种胃癌辅助诊断检测试剂盒，该试剂盒是基于PCR平台miRNA两步法检测试剂盒，说明书中所述的所有两步法检测体系为构建该试剂盒的理论基础。包含microRNA分子标志物特异性茎环结构逆转录引物、PCR上游引物、PCR通用下游引物，用于检测microRNA分子标记物的特异探针；所述特异性茎环结构逆转录引物的颈部的loop环部设计非连续互补碱基对TGCG和CGCA构成钥匙状结构，逆转录反应时通过连接酶将短臂与microRNA分子相连接。进一步，所述的分子标志物miR-106a逆转录引物序列如SEQIDNO.1：5’-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCCTACCTG-3’；miR-106aPCR上游引物序列如SEQIDNO.2：5’-GAGGTCAGGGAAAAGTGCTTACAGTGCA-3’；miR-106aPCR通用下游引物序列如SEQIDNO.3：5'-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；miR-106a特异探针序列如SEQIDNO.4：5'-FAM-TTTCCTCATCCTACCTG-MGB-3'；所述的分子标志物miR-375逆转录引物序列如SEQIDNO.5：5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCACTCGGGG-3'；miR-375PCR上游引物序列如SEQIDNO.6：5'-CTCCGTCAGGGTCCTGTACTGAGCTG-3'；miR-375PCR通用下游引物序列如SEQIDNO.3：5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；miR-375特异探针序列如SEQIDNO.7：5'-FAM-TTTCCTCATCACTCGGGG-MGB-3'所述的分子标志物miR-148a逆转录引物序列如SEQIDNO.8：5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCACAGACTC-3'；miR-148aPCR上游引物序列如SEQIDNO.9：5'-CTCCGTCAGGGTCCTTCATTCCACCG-3'；miR-148aPCR通用下游引物序列如SEQIDNO.3：5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；miR-148a特异探针序列如SEQIDNO.10:5'-FAM-TTTCCTCATCACAGACTC-MGB-3'；所述的分子标志物let-7a逆转录引物序列如SEQIDNO.11：5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCAACTATAC-3'；let-7aPCR上游引物序列如SEQIDNO.12：5'-CTCCGTCAGGGTGAGGTAGTAGGTT-3'；let-7aPCR通用下游引物序列如SEQIDNO.3：5'－CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；let-7a特异探针序列如SEQIDNO.13：5'-FAM-TTTCCTCATCAACTATAC-MGB-3'更进一步，还包括胃癌外泌体miRNA标准品：miR-106a分子标志物标准品为miR-106a，稀释后浓度为1011copy/μL，并梯度稀释为系列标准品；miR-375分子标志物标准品为miR-375，稀释后浓度为1011copy/μL；miR-148a分子标志物标准品为miR-148a，稀释后浓度为1011copy/μL；Let-7a分子标志物标准品为Let-7a，稀释后浓度为1011copy/μL。本专利技术还公开了一种基于miRNA双通道检测体系，包含分子标志物miR-106a、miR-375、miR-148a、let-7a；FAM及H本文档来自技高网...

【技术保护点】
胃癌外泌体miRNA分子在制备诊断和预示胃癌标志物中的应用。

【技术特征摘要】
2017.10.13 CN 20171095468761.胃癌外泌体miRNA分子在制备诊断和预示胃癌标志物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述胃癌外泌体miRNA分子为miR-106a、miR-375、miR-148a或Let-7a中至少两种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述标志物为miR-106a与miR-375联合，miR-106a与miR-148a联合或miR-106a与Let-7a联合。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断和预示为胃癌筛查、辅助诊断、疗效评价、预后评估或复发监控。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述胃癌外泌体来源于体液或细胞。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述体液包括血液、痰液、胃液、胃部灌洗液、尿液或唾液中的至少一种。7.检测权利要求1～6任一项所述胃癌外泌体相关microRNA分子的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为基于PCR平台miRNA两步法检测试剂盒。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为基于PCR平台miRNA两步法检测试剂盒，含microRNA分子标志物特异性茎环结构逆转录引物、PCR上游引物、PCR通用下游引物，用于检测microRNA分子标记物的特异探针；所述特异性茎环结构逆转录引物的颈部的loop环部设计非连续互补碱基对TGCG和CGCA构成钥匙状结构，逆转录反应时通过连接酶将短臂与microRNA分子相连接。9.权利要求7中所述的检测试剂盒，其特征在于：所述胃癌外泌体miRNA分子为miR-106a、miR-375、miR-148a或Let-7a中至少两...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弢，渠香云，贾云莉，董肇楠，马雪情，
申请(专利权)人：江苏为真生物医药技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32