一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种卤代醇脱卤酶突变体及其在合成阿托伐他汀关键中间体(3R,5R)6‑腈基‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述卤代醇脱卤酶突变体HheC‑A氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供了的1株卤代醇脱卤酶突变体，与野生酶相比，其催化活性提高了22倍，比活力提高了约20倍。将突变体HheC‑A用于全细胞催化D3转化A7的反应过程，当D3的投料量为50g/L时，9小时内D3转化率为92％，A7得率72％。突变体HheC‑A催化D3转化为A7的产物得率是野生酶HheC的4.8倍。

A mutant of halogenated dehalogenin and its application

The present invention discloses a halogenated alcohol dehalogenenzyme mutant and its application in the synthesis of the key intermediate of atorvastatin (3R, 5R) 6 nitrile base 3,5 two hydroxyhexanate tert butyl ester, and the halogenate dehalogenenzyme mutant HheC A amino acid sequence SEQ ID NO.2. The invention provides 1 halogenated alcohol dehalogenase mutants, compared with the wild enzyme, the catalytic activity is increased by 22 times, and the specific activity is increased by about 20 times. The mutant HheC? A was used to catalyze the transformation of D3 into A7 by whole cell catalysis. When the dosage of D3 was 50g/L, the D3 conversion rate was 92% in 9 hours, and the A7 yield was 72%. The yield of D3 transformed into A7 by mutant HheC A was 4.8 times that of HheC.

【技术实现步骤摘要】
一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用(一)
本专利技术涉及一种卤代醇脱卤酶的突变体及其应用。(二)
技术介绍
心脑血管疾病是一种严重威胁人类，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。2015年国内调血脂类药物总体市场已超过200亿元人民币，他汀类药物独占鳌头，国内他汀药物终端零售价市场达到了151.43亿元的规模，占整个降血脂用药市场近80％。其中，阿托伐他汀上市近20年的临床证明，药物安全性高、不良反应小，在降低LDL胆固醇治疗方面优于其它他汀类药物。2015年，中国阿托伐他汀总体市场达到了83.19亿元，同比上一年增长了7.97％，并仍呈现逐年上涨的趋势。随着市场竞争的日益加剧以及企业社会责任的落实，阿托伐他丁的生产技术亟需改进和创新，一方面需减少工业生产对环境资源的破坏及能源的浪费，另一方面可降低企业成本和患者用药成本，以提升整个行业的经济效益和社会效益。采用生物催化技术升级阿托伐他汀药物关鍵中间体合成技术，能够建立节能、绿色、高效的新生产工艺。卤代醇脱卤酶具有一步转化法替代高能耗和高溶剂用量的化学合成步骤，具备高效催化的特性，适用于建立低能耗、低成本和环保的阿托伐他汀侧链合成新工艺。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种高效催化合成阿托伐他汀关键中间体(3R,5R)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)合成的卤代醇脱卤酶突变体及其应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种卤代醇脱卤酶突变体(HheC-A)，所述卤代醇脱卤酶突变体HheC-A氨基酸序列SEQIDNO.2所示。本专利技术所述卤代醇脱卤酶突变体HheC-A基因是将源于根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens卤代醇脱卤酶HheC(氨基酸序列SEQIDNO.4)的人工合成基因，进行体外定向进化后，最终筛选得到的突变体。本专利技术还提供一种所述卤代醇脱卤酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还涉及一种所述编码基因构建的重组载体及重组载体转化制备的重组基因工程菌。优选以pET28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主(大肠杆菌BL21(DE3))。本专利技术还提供一种所述卤代醇脱卤酶突变体在合成阿托伐他汀关键中间体(3R,5R)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述的应用以含卤代醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的含湿菌体的发酵液为反应介质，以(3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(D3)为底物构成pH8.0-9.0的反应体系，在35℃进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(3R,5R)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)。进一步，所述反应体系中，湿菌体用量为10～30g/L发酵液，所述底物终浓度为50g/L发酵液。进一步，所述发酵液按如下方法制备：(1)菌种活化：将含卤代醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌(优选(Escherichiacoli)BL21(DE3)(pET28a-hheC-A))接种到含有50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液；种子培养基组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO4·12H2O8.9g/L、KH2PO43.4g/L、NH4Cl2.67g/L、Na2SO40.71g/L、MgSO4·7H2O0.49g/L、卡那霉素50μg/L，溶剂为去离子水，pH7.0；(2)发酵培养：将种子液按体积浓度5％的接种量接种到发酵培养基中(装液量70％)，30℃培养6h；加入终浓度为5.0-7.0mM的α-乳糖，控制发酵温度22℃，继续发酵20h，得到所述的发酵液；所述发酵培养基质量组成：1％的蛋白胨、0.5％的酵母提取粉、54mM甘油、2.8mM葡萄糖、25mMNa2HPO4、25mMKH2PO4、50mMNH4Cl、5mMNa2SO4、2mMMgSO4、卡那霉素50μg/L，溶剂为去离子水，pH值自然。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了的1株卤代醇脱卤酶突变体，与野生酶相比，其催化活性提高了22倍，比活力提高了约20倍。将突变体HheC-A用于全细胞催化D3转化A7的反应过程，当D3的投料量为50g/L时，9小时内D3转化率为92％(部分水解)，A7得率72％。突变体HheC-A催化D3转化为A7的产物得率是野生酶HheC的4.8倍。(四)附图说明图1为pET28a-hheC载体的结构示意图。图2为突变体酶活与野生型酶HheC的酶活比较。图3为催化过程中底物D3、中间环氧产物和产物A7的变化。(A)：野生型卤代醇脱卤酶HheC全细胞催化D3转化A7的反应过程；(B)：突变体HheC-A全细胞催化D3转化A7的反应过程。图4底物D3、中间环氧产物和产物A7气相分析色谱图。(A)：0.5g/LD3(D3标准品溶解在乙酸乙酯中)的气相分析色谱图；(B)：0.5g/LA7(A7标准品溶解在乙酸乙酯中)的气相分析色谱图；(C)：催化反应过程取样进行气相分析的典型色图谱。其中标记的色谱峰a、色谱峰b和色谱峰c分别是底物D3、中间环氧产物和产物A7。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：LB培养基组成：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl10.0g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。种子培养基组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO4·12H2O8.9g/L、KH2PO43.4g/L、NH4Cl2.67g/L、Na2SO40.71g/L、MgSO4·7H2O0.49g/L、卡那霉素50μg/L，溶剂为去离子水，pH7.0。发酵培养基组成：1％的蛋白胨、0.5％的酵母提取粉、54mM甘油、2.8mM葡萄糖、25mMNa2HPO4、25mMKH2PO4、50mMNH4Cl、5mMNa2SO4、2mMMgSO4、卡那霉素50μg/L，溶剂为去离子水，pH值自然。实施例1、根癌农杆菌A.tumefaciens卤代醇脱卤酶HheC基因的人工合成及其突变体HheC-A的筛选一、构建高效A.tumefaciens卤代醇脱卤酶HheC基因的大肠杆菌根据GenBank数据库中根癌农杆菌A.tumefaciens卤代醇脱卤酶HheC基因的氨基酸序列(ID：AF397296)，由基因合成公司合成密码子优化的HheC基因(序列如SEQIDNO.3，氨基酸序列为SEQIDNO.4所示)，该基因合成时直接插入到pET28a质粒的NdeI/HindIII酶切位点之间，如图1所示，得到重组表达质粒pET28a-hheC。将重组质粒pET28a-hheC转化到E.coliBL21(DE3)的高效感受态细胞，在含卡那霉素的LB琼脂平板上筛选，得到重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)(pET28a-hheC)。二、卤代醇脱卤酶HheC基因的体外定向进化首先采用易错PCR方法进行定向进化和筛选。根据合成的hheC序列(SEQIDNO.3)，设计PCR扩增引物(hheC-F:5′-GCAGCCATATGAGCACAGCGATTGTGAC-3′，hheC-R:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卤代醇脱卤酶突变体，其特征在于所述卤代醇脱卤酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种卤代醇脱卤酶突变体，其特征在于所述卤代醇脱卤酶突变体氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。2.一种权利要求1所述卤代醇脱卤酶突变体的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.一种权利要求2所述编码基因构建的重组载体。5.一种权利要求4所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。6.一种权利要求1所述卤代醇脱卤酶突变体在合成阿托伐他汀关键中间体(3R,5R)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用以含卤代醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的含湿菌体的发酵液为反应介质，以(3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯为底物构成pH8.0-9.0的反应体系，在35℃进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(3R,5R)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体用量为10～30g/L发酵液，所述底物终浓度为50g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，金辉，朱林江，梅光耀，陆跃乐，范永仙，汪海波，林金荣，
申请(专利权)人：浙江宏元药业股份有限公司，浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33