一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法及应用技术

本发明专利技术涉及口腔护理产品抗菌功效评价技术领域，具体为一种牙菌斑生物膜模型的培养方法、优化的生物膜活菌计数法及快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法。本发明专利技术提供的牙菌斑生物膜模型的培养方法通过优化培养条件，能培养形成可提高对口腔护理产品抗菌功效评价准确度的牙菌斑生物膜模型。本发明专利技术提供的优化的生物膜活菌计数法可提高活菌计数结果，更加接近真实的生物膜上活体细菌的数目。本发明专利技术提供的快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，不仅检测结果较游离菌法更接近消费者实际使用后的评价结果，还能大幅减少口腔产品的功效评价耗时，从而可为快速区分口腔产品功效提供数据支持，并且重复性强，结果稳定性好；成本较低，培养条件容易满足。

A method for culturing dental plaque biofilm model and optimized biofilm counting method and its application

The invention relates to the field of oral nursing product antibacterial efficacy evaluation, in particular, a cultivation method of a dental plaque biofilm model, an optimized biological membrane living bacteria counting method and a method for rapid evaluation of the antibacterial efficacy of oral nursing products. The cultivation method of the dental plaque biofilm model provided by the invention can develop a dental plaque biofilm model which can improve the accuracy of evaluating the antibacterial efficacy of oral care products by optimizing the culture conditions. The optimized biofilm counting method provided by the invention can improve the counting result of live bacteria, and is closer to the number of living bacteria on the real biofilm. The method of rapid evaluation of antibacterial efficacy of oral care products is not only more closely related to the evaluation results than the free bacteria method, but also significantly reduces the time of evaluation of the efficacy of oral products, thus providing data support for the rapid differentiation of oral products' efficacy, and strong repeatability. The fruit has good stability, low cost and easy to meet the cultivation conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法及应用
本专利技术涉及口腔护理产品抗菌功效评价
，具体涉及一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法，以及利用牙菌斑生物膜模型评价口腔护理产品的杀菌功效和抑菌功效的方法。
技术介绍
口腔里生存着多种多样的微生物，包括细菌、真菌、病毒、支原体、原虫等，其存在形式包括游离态和聚集态，游离态的微生物称为浮游微生物，聚集态的微生物主要以牙菌斑生物膜的形式存在于人的口腔。与游离态相比，以生物膜形式存在的微生物群具有以下特点：(1)微生物之间相互积聚和定殖，具有空间和环境的多样性；(2)活性强，能够抵御苛刻的环境而存活；(3)耐受性强，对抗菌剂敏感性下降；(4)能表达不同于浮游细菌的表型。牙菌斑生物膜中微生物的生存能力、抗药性、代谢效率均显著高于浮游微生物；两者呈现完全不同的生理特征。口腔里众多的微生物彼此之间处于一种平衡状态，一旦这种平衡被打破，就将导致龋齿，牙龈炎，牙周炎和口源性口臭病等口腔多微生物疾病的发生。牙菌斑是一种经典的生物膜，是粘附在牙齿表面或口腔其他软组织上的微生物群，这些微生物大多为兼性厌氧菌或者严格厌氧菌，其代谢活性强，比菌斑生物膜外的微生物更难被杀灭或祛除，从而大大增加了龋病和牙周病等口腔疾病发生的几率。因此是否能够有效预防和抑制牙菌斑成为了评价口腔护理产品的一个重要指标之一。长期以来，牙膏、漱口水等口腔护理产品的抗菌功效体外检测主要是通过对游离菌的抗菌功效来评价。目前的体外检测方法主要采用菌悬液抗菌测试法、微量肉汤稀释法检测最小抑菌浓度MIC等试验来检验口腔护理产品对口腔游离细菌的抗菌作用。显然，口腔护理产品对于游离菌的抗菌效能和对生物膜的抗菌效能不能等同视之。例如，口腔护理产品对游离菌的效果是以悬液法测定产品的抑菌率(InhibitionRate,IR)来评价，大部分样品的结果为＞99.9％。口腔中大多数的致病菌是存在于牙菌斑生物膜中，导致生物膜中的微生物远比游离菌难被杀灭，口腔护理产品中的抗菌剂必须渗透到生物膜内部才能发挥作用。因此，针对游离菌的悬液法抗菌测试难以反映口腔护理产品对于口腔内微生物真实的杀灭/抑制效果。综上所述，游离菌的抗菌测试方法(或称游离菌法)不能获得真实情况下口腔产品抗菌效能评价数据，难以指引相关产品的开发和优化。为了获得更加接近真实情况的结果，牙膏、漱口水等口腔护理产品对生物膜的抗菌功效的评价目前主要是通过临床试验来完成。临床试验是一种较为真实和客观地评价产品对生物膜抗菌效能的方法，其结果相对可靠又有代表性，但也存在一些明显的缺点：(1)耗时长，约需1周；(2)费用高；(3)受测个体差异性大；(4)需要受测个体的高度配合。口腔护理产品的前期配方研究需要对大量不同浓度的抗菌原料进行筛选，临床试验不利于口腔护理产品的前期大量配方的筛选工作。因此，建立一种快速、重复性强、结果可信的抗菌功效测试与评价方法，对于口腔护理产品的开发和配方筛选是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供一种可靠的且可提高对口腔护理产品抗菌功效评价准确度的牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法，以及可快速高效、重复性强的评价口腔护理产品抗菌功效的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，包括以下步骤：S101、在无氧气氛及恒温的环境中，分别对各种口腔致病菌在TSA补加培养基平板上划线培养2～6天至平板上出现大量菌苔；S102、将经步骤S101培养后的各种口腔致病菌分别接种到BHI富集培养基，在无氧气氛及恒温的环境中分别培养1～3天至BHI富集培养基浑浊，得到各种口腔致病菌的成熟菌悬液；S103、将步骤S102所得的各种成熟菌悬液添加到含附着力促进剂的BHI富集培养基中，每一种成熟菌悬液的体积百分比为2％～8％；然后在无氧气氛及恒温的环境中接种到成膜介质的孔中，培养14～18小时，在成膜介质的孔底上形成牙菌斑生物膜模型；所述TSA补加培养基是指每升TSA培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；所述BHI富集培养基是指每升BHI培养基中含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；所述附着力促进剂为碳酸钙悬浊液，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.1％～0.5％。更优选的，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.2％。优选的，所述口腔致病菌包含血链球菌、变异链球菌、粘性放线菌、鼠李糖乳杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌。优选的，所述无氧气氛是指由体积比为80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳构成的气体环境。优选的，所述恒温的温度为36℃。优选的，所述成膜介质为牙齿、玻片、羟磷灰石片或塑料片。更优选的，所述成膜介质为TC处理的细胞培养板。一种优化的生物膜活菌计数法，所述生物膜为以上所述的牙菌斑生物膜模型，所述优化的生物膜活菌计数法包括以下步骤：S201消化分散：牙菌斑生物膜模型使用TC处理的24孔细胞培养板培养形成时，牙菌斑生物膜模型的孔中加入100～200μL质量百分比为0.25％的胰酶溶液，常温消化5min后再沿孔壁向孔中加入BHI富集培养基至总体积为1mL，接着将生物膜吹打混匀重悬形成生物膜菌悬液后转移至无菌离心管中；S202超声分散：将装有生物膜菌悬液的离心管置于超声波清洗仪中并在25℃下超声6min；S203计数：用活菌计数法测定生物膜菌悬液中的细菌数目，即为牙菌斑生物膜中的活菌数目。一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，包括以下步骤：S301、沿以上所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；S302、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入与样品溶液等体积的以上所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；S303、重复步骤S302两次；S304、用以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定经步骤S303处理的牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为NS；S305、在以上所述且未经口腔护理产品样品溶液处理的牙菌斑生物膜模型孔中重复步骤S302和S303，然后用以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定该孔中的细菌数目，为没有经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为NC；S306、口腔护理产品的对牙菌斑生物膜模型的相对杀菌率BRSR为或LgNc-LgNs。另一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，包括以下步骤：S401、沿以上所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；S402、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入等体积以上所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；S403、重复步骤S402两次；S404、向牙菌斑生物膜模型的孔中加入1mL的BHI富集培养基，并将牙菌斑生物膜模型置于无氧气氛及恒温的环境培养4～8小时；S405、吸取并弃去经步骤S404处理的牙菌斑生物膜模型孔中的菌悬液，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S101、在无氧气氛及恒温的环境中，分别对各种口腔致病菌在TSA补加培养基平板上划线培养2～6天至平板上出现大量菌苔；S102、将经步骤S101培养后的各种口腔致病菌分别接种到BHI富集培养基，在无氧气氛及恒温的环境中分别培养1～3天至BHI富集培养基浑浊，得到各种口腔致病菌的成熟菌悬液；S103、将步骤S102所得的各种成熟菌悬液添加到含附着力促进剂的BHI富集培养基中，每一种成熟菌悬液的体积百分比为2％～8％；然后在无氧气氛及恒温的环境中接种到成膜介质的孔中，培养14～18小时，在成膜介质的孔底上形成牙菌斑生物膜模型；所述TSA补加培养基是指每升TSA培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L‑半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；所述BHI富集培养基是指每升BHI培养基中含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D‑甘露糖、0.5克L‑半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；所述附着力促进剂为碳酸钙悬浊液，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.1％～0.5％。

【技术特征摘要】
1.一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S101、在无氧气氛及恒温的环境中，分别对各种口腔致病菌在TSA补加培养基平板上划线培养2～6天至平板上出现大量菌苔；S102、将经步骤S101培养后的各种口腔致病菌分别接种到BHI富集培养基，在无氧气氛及恒温的环境中分别培养1～3天至BHI富集培养基浑浊，得到各种口腔致病菌的成熟菌悬液；S103、将步骤S102所得的各种成熟菌悬液添加到含附着力促进剂的BHI富集培养基中，每一种成熟菌悬液的体积百分比为2％～8％；然后在无氧气氛及恒温的环境中接种到成膜介质的孔中，培养14～18小时，在成膜介质的孔底上形成牙菌斑生物膜模型；所述TSA补加培养基是指每升TSA培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；所述BHI富集培养基是指每升BHI培养基中含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；所述附着力促进剂为碳酸钙悬浊液，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.1％～0.5％。2.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.2％。3.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述口腔致病菌包含血链球菌、变异链球菌、粘性放线菌、鼠李糖乳杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌。4.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述无氧气氛是指由体积比为80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳构成的气体环境。5.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述恒温的温度为36℃。6.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于：所述成膜介质为TC处理细胞培养板。7.一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，所述生物膜为权利要求1所述的牙菌斑生物膜模型，所述优化的生物膜活菌计数法包括以下步骤：S201消化分散：牙菌斑生物膜模型使用TC处理的24孔细胞培养板培养形成时，向牙菌斑生物膜模型的孔中加入100～200μL质量百分比为0.25％的胰酶溶液，常温消化5min后再沿孔壁向孔中加入BHI富集培养基至总体积为1mL，接着将生物膜吹打混匀重悬形成生物膜菌悬液后转移至无菌离心管中；S202超声分散：将装有生物膜菌悬液的离心管置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李淑钰，江丹，钟美，邱振名，黄亮，张利萍，
申请(专利权)人：广州立白企业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44