一种无创肺纤维化模型的建立方法技术

本发明专利技术涉及一种肺纤维化动物模型的建立方法，即通过鼻腔滴入PM2.5混悬液制备肺纤维化动物模型。其优点表现在：本发明专利技术首次提出PM2.5鼻腔滴入建立小鼠肺纤维化模型，并通过实验验证了可行性，连续8周PM2.5鼻腔滴入可诱导小鼠肺纤维化。本发明专利技术的肺纤维化模型的建立方法没有使用博来霉素，并非通过气管滴入，操作简便，创伤性小。

A method for establishing noninvasive pulmonary fibrosis model

The invention relates to a method for establishing an animal model of pulmonary fibrosis, that is, preparing a pulmonary fibrosis animal model by instilling PM2.5 suspension into the nasal cavity. The advantages of this invention are as follows: this invention first proposed PM2.5 nasal drip to establish a model of pulmonary fibrosis in mice, and the feasibility was verified by experiments. 8 weeks of PM2.5 instillation of the nasal cavity could induce pulmonary fibrosis in mice. The method of establishing the pulmonary fibrosis model of the invention does not use bleomycin, and is not dripped through the trachea.

【技术实现步骤摘要】
一种无创肺纤维化模型的建立方法
本专利技术涉及动物模型
，具体地说，是一种无创肺纤维化模型的建立方法。
技术介绍
随着工业化、城市化的进程，空气污染日益加剧，细颗粒物(PM2.5)作为最主要的空气污染物，严重威胁着人类健康。流行病学调查表明，空气中PM2.5浓度的升高与冠心病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等心肺系统疾病的发病及症状加重密切相关。PM2.5的空气动力学粒径小，随呼吸进入肺部后，极易沉积于远端小气道和肺泡，并从气道上皮进入肺组织间隙、甚至进入血液循环，可诱导炎症反应和氧化应激损伤，引起血管通透性增高和肺组织损伤。调查表明长期暴露于PM2.5环境中(即使污染程度相对较轻)，机体的肺功能也会不断下降，主要表现在FEV1和FVC的降低。目前常用的肺纤维化模型以博来霉素气管内滴注为主，但此法诱导的肺纤维化有自限性，且该方法是经气管滴入，操作难度较高，具有创伤性。因此，非常有必要建立一种相对简便且创伤性小的方法。中国专利文献CN107115343A公开了一种通过胺碘酮和盐酸萘甲唑啉采用加样枪通过鼻腔给药建立大鼠肺细胞纤维化模型的方法。中国专利文献CN107469069A公开了一种向恒河猴皮下注射百草枯溶液、气管滴注博来霉素溶液建立肺纤维化动物模型的方法。中国专利文献CN106309479A公开了一种采用温石棉纤维非暴露法气管滴注SPF级C57/BL6小鼠建立肺纤维化动物模型的方法。中国专利文献CN105311618A公开了一种应用介导肺纤维化发生的重要启动因子作为诱导剂，采用血管紧张素Ⅱ皮下注射建立肺纤维化动物模型的方法。中国专利文献CN104605958A公开了一种采用内窥镜引导下气管内灌注的滴注菌液方式制作肺纤维化动物模型的方法。而有关PM2.5的专利、科技论文等医学方面的文献，主要是关于如何防治PM2.5引发疾病的报道，关于本专利技术的利用PM2.5鼻腔滴入建立小鼠肺纤维化模型的方法目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供PM2.5的一种新用途。本专利技术的第二个目的是，提供一种无创肺纤维化模型的建立方法。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：PM2.5在制备肺纤维化动物模型中的应用。进一步地，PM2.5混悬液在制备肺纤维化动物模型中的应用。进一步地，所述的PM2.5混悬液为PM2.5用PBS缓冲液配制而成。进一步地，所述的动物为啮齿类动物。进一步地，所述的啮齿类动物为小鼠。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种肺纤维化动物模型的建立方法，通过鼻腔滴入PM2.5混悬液制备肺纤维化动物模型。进一步地，所述的PM2.5混悬液为PM2.5用PBS缓冲液配制而成。进一步地，所述的PM2.5混悬液的制备方法为：使用PM2.5采样器，采用玻璃纤维滤膜，采集大气PM2.5，将采集到颗粒物的滤膜置于去离子水中，使用超声波清洗器洗脱下来，然后冷冻真空干燥，收集PM2.5，用PBS缓冲液配制成PM2.5混悬液，超声震荡混匀。进一步地，所述的PM2.5混悬液剂量为7.8mg/kg，滴注体积为50μl，每周2次，连续滴注8周。进一步地，所述的动物为小鼠。本专利技术优点在于：1、本专利技术首次提出PM2.5鼻腔滴入建立小鼠肺纤维化模型，并通过实验验证了可行性，连续8周PM2.5鼻腔滴入可诱导小鼠肺纤维化。PM2.5鼻腔滴入导致小鼠的吸气量降低、肺顺应性降低和呼吸气流阻塞，BALF中炎症细胞总数增加，肺部组织中炎症积分增加、气道胶原沉积厚度增加、肺组织羟脯胺酸含量增加，同时平均肺泡内衬间隔无改变。2、本专利技术的肺纤维化模型的建立方法没有使用博来霉素，并非通过气管滴入，操作简便，创伤性小。附图说明附图1是对照组肺组织的HE染色图片。附图2是PM2.5滴入组肺组织的HE染色图片。附图3是对照组气管的Masson染色图片。附图4是PM2.5滴入组气管的Masson染色图片。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1材料与方法一、材料8-10周SPF级C57/BL6小鼠，体重22-25g，购自上海西必普凯公司，饲养于本院动物中心的屏障系统，本研究得到医院伦理委员会的批准。小动物气体麻醉机由上海玉研仪器公司提供。异氟烷由上海玉研仪器公司提供。肺功能仪(ForcedManeuvers系统)由英国EMMS公司提供。细胞离心机(ShandonCytospin)由美国ThermoFisher公司提供。刘氏染液由珠海贝索生物技术有限公司提供。羟脯氨酸试剂盒购于南京建成生物工程研究所。二、大气PM2.5采样及处理2016年10月到2017年4月，于上海市非工业区使用崂应2030型中流量PM2.5采样器(青岛崂山应用技术研究所)采用玻璃纤维滤膜(青岛崂山应用技术研究所)采集大气PM2.5，将采集到颗粒物的滤膜置于去离子水中，使用超声波清洗器洗脱下来，然后冷冻真空干燥，收集PM2.5，-20℃干燥保存。使用前，称取一定量的PM2.5，用PBS缓冲液配制成PM2.5混悬液，超声震荡混匀，4℃保存。三、方法1.PM2.5暴露：16只C57/BL6小鼠在动物实验室内饲养一周后，随机分为两组分笼饲养，分别标记为对照组、PM2.5鼻腔滴入组，每组8只。小鼠置于气体麻醉机密封箱中，给予异氟烷麻醉，模型组鼻腔滴入PM2.5混悬液，剂量为7.8mg/kg，滴注体积为每只50μl。对照组小鼠鼻腔内滴入生理盐水50μl。每周两次，连续滴注8周。2.肺功能检测：腹腔注射0.15-0.2ml的1％戊巴比妥钠150-200μl后，小鼠气管切开，插入气管导管，置入体积描记箱(ForcedManeuvers系统)，并连接电脑控制的呼吸机，呼吸频率150次/分。测量吸气量(IC)、功能残气量(FRC)、肺总量(TLC)、用力呼气量(FVC)、第20ms、50ms的用力呼气量(FEV25，FEV50)、顺应性(Cchord)。3.支气管肺泡灌洗液(BALF)：腹腔注射0.4ml的1％戊巴比妥钠以处死小鼠。应用2ml的PBS进行支气管肺泡灌洗，回收BALF。在心脏的右心室穿刺获得血液。BALF离心，细胞颗粒重悬，计数后，在细胞离心机制片，采用刘氏染液染色。显微镜下计数至少500个细胞，并区分各类炎症细胞的比例。4.组织病理分析：左肺应用4％福尔马林灌注、固定，石蜡包埋，切片，片厚4μm，进行HE染色及Masson染色。HE染色评估支气管周围的肺部炎症积分。0＝无炎症反应，1＝轻度炎症反应，支气管壁、血管壁或肺泡间隔有少量炎症细胞，2＝中度炎症反应，支气管壁、血管壁、肺泡间隔有成片炎症，3＝重度炎症反应，支气管壁、血管壁、肺泡间隔有广泛的炎症。在显微镜下，测量平均内衬间隔(Lm)，应用目镜测微尺，计数5条线(长度500μm)上的肺泡间隔数。Lm(μm)＝500/肺泡间隔数。Masson染色后，通过ImageJ图像分析软件测量气道上皮下胶原沉积面积、气道基底膜周长，计算气道上皮下胶原沉积厚度(Wcol/Pbm)。5.肺组织羟脯氨酸的测定：用碱水解法按试剂盒说明书操作测定肺组织羟脯氨酸含量，计算公式：羟脯氨酸含量(μg/mg湿重)＝(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量本文档来自技高网...

【技术保护点】
PM2.5在制备肺纤维化动物模型中的应用。

【技术特征摘要】
1.PM2.5在制备肺纤维化动物模型中的应用。2.PM2.5混悬液在制备肺纤维化动物模型中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的PM2.5混悬液为PM2.5用PBS缓冲液配制而成。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的动物为啮齿类动物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的啮齿类动物为小鼠。6.一种肺纤维化动物模型的建立方法，其特征在于，通过鼻腔滴入PM2.5混悬液制备肺纤维化动物模型。7.根据权利要求6所述的建立方法，其特征在于，所述的PM2.5混悬液为PM2.5用P...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锋，徐蒙蒙，张妍蓓，张海，陈宇清，周新，
申请(专利权)人：上海市胸科医院，
类型：发明
国别省市：上海,31