一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：磁微粒偶联的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）捕获抗体、吖啶酯标记的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体、中性粒细胞弹性蛋白酶校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。本发明专利技术试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系。与现有技术相比，本发明专利技术建立的直接化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速，检测时间短，检测结果具有更高的准确性与重复性，该试剂盒可适用于各种发光检测仪器。

Chemiluminescence detection kit for neutrophil elastase and preparation method thereof

The invention discloses a chemiluminescence detection kit for neutrophil elastase and a preparation method thereof. The kit includes: magnetic particle coupled neutrophil elastase (NE) capture antibody, acridine labeled neutrophil elastase (NE) detection antibody, neutrophil elastase calibrator, chemiluminescence preexcitation solution A, chemiluminescence excitation solution B, cleaning solution. The reagent kit combines chemiluminescence technology with immunomagnetic particles to provide a near homogeneous reaction system. Compared with the existing technology, the direct chemiluminescence method established by the present invention has high sensitivity, high specificity, accurate and rapid, short detection time, higher accuracy and repeatability of detection results, and the kit can be applied to various luminescent detection instruments.

【技术实现步骤摘要】
一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其制备方法
本专利技术属于免疫检测分析领域，具体是一种中性粒细胞弹性蛋白酶的免疫化学发光检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是一种分子量为30000、由218个氨基酸组成的单链糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族。它来源于中性粒细胞，在单核细胞中也有少量的存在。中性粒细胞内的弹性蛋白酶浓度超过5mM，每个中性粒细胞含有大约400个弹性蛋白酶阳性颗粒，估计细胞总量在3pg以上，并被严格地控制在中性粒细胞嗜苯胺蓝体的颗粒内。当中性粒细胞被激活后，从嗜苯胺蓝颗粒中释放出多种蛋白水解酶，包括丝氨酸酶、弹性蛋白酶等多种蛋白酶，而弹性蛋白酶是其中含量高、作用范围广、水解能力强的蛋白水解酶之一。它能降解细胞外基质，并能引起内皮细胞的分离、溶解或屏障功能破坏。细胞外基质是动脉粥样斑块的主要成分，主要由胶原、弹性蛋白、非胶原糖蛋白及蛋白多糖等组成。它与细胞黏合在一起并交织成有序的网状，赋予斑块的完整性。细胞外基质的含量、厚度及强度对于防止斑块破裂至关重要。NE除分解弹性蛋白外，还能分解连接组织的其他成分，如胶原蛋白、纤维连接蛋白。而且还能诱导细胞因子的表达，如白细胞介素-8（IL-8）、粒细胞刺激因子β、血小板生长因子和内皮素，而这些物质又能吸引和激活中性粒细胞释放更多的NE。NE的这些多重效应构成了一个级联(cascade)的网络而形成恶性循环。以上形成的恶性循环使细胞外基质过度降解，斑块趋于不稳定，在临床表现为不稳定性心绞痛（UAP）、急性心肌梗死（AMI）甚至猝死发生。研究发现不稳定斑块具有纤维帽薄、脂质丰富、斑块内炎症反应活跃的特点，容易破裂及血栓形成，引起急性冠状动脉综合征（ACS）。炎症细胞对不稳定斑块的侵蚀可能是引起ACS的机制。及时识别不稳定斑块，并积极治疗可望减少ACS的发生。所以我们对NE的检测具有非常重要的作用。目前中性粒细胞弹性蛋白酶检测的方法有：酶联免疫法等。酶联免疫法采用的酶为辣根过氧化物酶，采用辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。本专利技术采用吖啶酯标记，具有如下优点：①背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；②闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；③吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，提高系统整体灵敏度；④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑤标记物稳定，不受环境氧化剂的影响(在2-8℃下可保存数月之久)。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。本专利技术采用的方法为化学发光法，其优点为：灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、线性范围宽，检测结果具有更高的准确性与重复性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种具有较高灵敏度和特异性的检测中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及制备方法，本专利技术所提供的化学发光法检测中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂盒，采取磁微粒偶联中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）捕获抗体，吖啶酯标记中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体。试剂盒还包括中性粒细胞弹性蛋白酶校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。作为本专利技术进一步的方案，所述的磁微粒可直接与中性粒细胞弹性蛋白酶抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记中性粒细胞弹性蛋白酶抗体。作为本专利技术进一步的方案，所述磁珠的表面修饰基团为羧基、氨基、链霉亲和素-生物素或对甲苯磺酰基。磁珠使用前固相的不完全沉降会影响精确度，因此选择时应选分散性好，沉降速度慢的磁珠。作为本专利技术进一步的方案，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如：NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。作为本专利技术进一步的方案，所述的吖啶酯标记的是中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体。作为本专利技术进一步的方案，所述的吖啶酯标记中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体的缓冲液是pH8.0-11.0、浓度为0.01-0.20mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液。作为本专利技术进一步的方案，所述的吖啶酯与抗体的摩尔比为5-100:1。作为本专利技术进一步的方案，所述的吖啶酯溶于DMSO或DMF中，且所配制溶液的最终浓度为0.1-100mmol/L。作为本专利技术进一步的方案，所述的检测抗体和捕获抗体均是中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）单克隆抗体。作为本专利技术进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0%BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入中性粒细胞弹性蛋白酶纯品配置而成。作为本专利技术进一步的方案，所述的中性粒细胞弹性蛋白酶校准品溶液浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、15ng/mL、45ng/mL、135ng/mL、405ng/mL。作为本专利技术进一步的方案，所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.01-5.0%，HNO3浓度为0.01-1.0mol/L。作为本专利技术进一步的方案，所述的化学发光激发液B为TritonX-100和NaOH的混合液，其中TritonX-100的质量分数为0.01-2.0%，NaOH的浓度为0.05-1.0mol/L。作为本专利技术进一步的方案，所述的清洗液包括以下组分：pH值7.0-9.0、浓度为5.0-50.0mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。本专利技术的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子检测产物浓度。本专利技术的优点在于采用夹心法联合磁微粒化学发光技术以测定中性粒细胞弹性蛋白酶的含量。吖啶酯作为标记物的直接化学发光具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。具体实施方式本专利技术提供了一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒，为使本专利技术目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进行详细说明。本专利技术提供一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及制备方法，磁微粒偶联的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）捕获抗体、吖啶酯标记的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体。试剂盒还包括中性粒细胞弹性蛋白酶校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。具体地，本专利技术在制备磁微粒偶联捕获抗体的过程中，所述偶联抗体的缓冲液为pH值5.0-6.0、浓度为20-200mmol/LMES的缓冲液。具体地，本专利技术在制备磁微粒偶联捕获抗体的过程中，所述封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。具体地，本专利技术在制备吖啶酯标记检测抗体的过程中，所述的吖啶酯标记中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体的缓冲液是pH8.0-11.0、浓度为0.01-0.20mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。具体地，本专利技术所述校准品是由含有0.5-5.0%BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：磁微粒偶联的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）捕获抗体、吖啶酯标记的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体、中性粒细胞弹性蛋白酶校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。

【技术特征摘要】
1.一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：磁微粒偶联的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）捕获抗体、吖啶酯标记的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体、中性粒细胞弹性蛋白酶校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。2.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的磁珠的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。3.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的磁微粒可直接与中性粒细胞弹性蛋白酶捕获抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记中性粒细胞弹性蛋白酶捕获抗体。4.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。5.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹晶，刘丽青，胡雪婷，常燕，杜爱铭，徐兵，
申请(专利权)人：太原瑞盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西,14