一种表达重组人神经生长因子的表达载体、体系及方法技术

本发明专利技术涉及一种制备人神经生长因子(rhNGF)蛋白的真核表达体系和方法，使用了重组慢病毒载体及表达rhNGF的CHO细胞，经过一系列分离纯化步骤，最终得到高活性高纯度的人神经生长因子蛋白，具有市场前景。

Expression vector, system and method for expressing recombinant human nerve growth factor

The present invention relates to a eukaryotic expression system and method for preparing human nerve growth factor (rhNGF) protein. The recombinant lentivirus vector and the CHO cells expressing rhNGF are used. After a series of separation and purification steps, the human nerve growth factor protein with high activity and high purity is obtained, which has a market prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种表达重组人神经生长因子的表达载体、体系及方法
本专利技术涉及一种表达人神经生长因子(rhNGF)蛋白的真核细胞表达体系；本专利技术还涉及重组人神经生长因子的制备方法。
技术介绍
神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，是神经系统最重要的生物活性分子之一，它对中枢的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，对调节神经元的生长、发育、分化、存活及损伤神经的再生修复具有重要的理论和临床意义。目前的基础研究表明NGF可应用于神经中毒、周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。NGF基因转录后生成NGFmRNA，mRNA翻译后首先合成NGF的前体蛋白。前体蛋白有两种，一种是长的前体蛋白，一种是短的前体蛋白。编码短的前体蛋白的mRNA位于单一的外显子内，所以NGF分为两种，即7SNGF和2.5SNGF，通常所指的NGF为2.5SNGF。2.5SNGF是由118个氨基酸组成的二聚体，整个NGF的生物活性全依赖β亚单位，其沉降系数为2.5S，又称2.5SNGF。完整的hNGF分子由1个β亚单位、2个α亚单位和2个γ亚单位以非共价键结合为α2βγ2的形式，分子中还包括2个锌指，以增加复合物的稳定性。β亚单位分子量为26518，其pI是9.3，通过非共价链结合而构成二聚体。其中，6个半胱氨基酸残基之间有二硫键相连，这些二硫键对维持NGF的生物活性十分重要，一旦破坏则活性全部丧失。hNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子(rhNGF)是唯一的选择。目前神经生长因子的上市产品主要来源于小鼠的颌下腺提取，而雄性小鼠颌下腺是纯化NGF和分析其生物活性的主要供体。我国研制的注射用鼠神经生长因子是获得国家食品药品监督管理局(SFDA)颁发的一类生物制品新药证书。中国药典2015版对鼠源NGF规定其蛋白质含量不低于0.1mg/ml,比活性不低于5*105AU/mg(国家药典委员会编，中华人民共和国药典2015版)。2001年厦门北大之路生物工程有限公司的NGF获批，成为全世界第一个NGF药品。截止目前，国内已经有多个厂家获批NGF，而且成为最畅销的药品之一，根据IMS数据，2016年我国NGF销量达1100万支，销售总额达2.15亿美元(按出厂价)。2017年7月6日，EMA批准了意大利Dompé公司的重组人神经生长因子(cenegermin)滴眼液用于中重度神经营养性角膜炎(NK)治疗，神经营养性角膜炎是一种罕见的眼科疾病，治疗方案缺乏，疗效差，因发病率不到万分之五，cenegermin被EMA授予了孤儿药资格。其二期临床试验的结果显示，本品都表现出非常好的疗效，治疗组的完全治愈率显著高于安慰剂组。本品安全性良好，主要不良反应是眼痛、流泪等。Oxervate通过重组DNA技术生产，避免了动物源NGF病毒的感染风险，而且质量更加可控。Oxervate以滴眼液(20μg/mL)的形式施用于神经营养性角膜炎患者，操作简单，辅助恢复眼的正常愈合过程，修复角膜损伤效果良好。该公司宣布Oxervate将在2017年年内登录欧洲市场，并准备向FDA和PMDA申请NDA。迄今为止，雄性小鼠颌下腺是纯化NGF和分析其生物活性的主要供体，但是鼠源NGF有以下几个显著缺点：①需要使用大量小鼠分离颌下腺组织，有悖于动物福利原则；②产品质量难以保证，并且，NGF含量低且难以避免异源蛋白质的污染；③组织材料预处理以及纯化工艺都较为复杂；④更重要的是鼠NGF氨基酸组成与空间结构与人NGF相比仍然存在明显差异，长期使用具有潜在的危险性，亟需研制重组人NGF进行升级换代，替代现有产品。基因重组NGF的生产较传统小鼠颌下腺提取工艺有明显优势。利用体外重组技术合成β-NGF，在原核细胞中虽然可获得表达,但因合成的多肽不能折叠使得活性较低(刘东海等.人神经生长因子β亚基cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达,中国病理生理杂志，2002,5:39-42)。在真核细胞中表达,更有利于得到活性较高和更接近自然合成的β-NGF蛋白,且因其分子小(分子量小于40kD)易于透过血脑屏障(韩晓枫等，人β-神经生长因子基因的体外扩增、克隆及其序列的分析，苏州医学院学报,1999，19(12):1271-1273.)。在真核细胞表达相对于原核细胞表达有较多优点:一、可使表达的蛋白质获得加工,如空间构型的折叠、糖基化和磷酸化等；二、可识别和除去外源基因中的内含子,剪切加工为成熟的mRNA；三、转染目的基因的真核细胞可冻存,复苏后能稳定表达活性目的蛋白(粟谋等，pcDNA3-hNGF真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达，中国骨质疏松杂志，2016，22(1)，41-44)。国外用真核系统大规模表达、纯化NGF已有成熟工艺，而用原核系统(E.coli)表达的rhNGF2β多因不能正确折叠而使生物学活性比鼠源的NGF低50倍，所以多建议用真核表达系统来克服蛋白错误折叠问题。近年来,研究人员通过构建具有前导序列的NGF来帮助其体外复性，虽然复性率有所提高，但产物需经限制酶切后才能获得成熟NGF，增加后续处理难度(栗炳南等，pIRES2-NGF-NT-3真核表达载体的构建与鉴定，生命科学研究，2014,18(4),315-322)。普遍认为，综合两种表达体系，哺乳动物表达系统具有分泌正确装配、折叠与糖基化等特点，更适合表达NGF。韩晓枫(韩晓枫等.人B-NGF基因在COS-7细胞中的表达及其生物学活性的研究.细胞与分子免疫学杂志,2001,4:310-313.)在COS-7细胞中对NGF进行了一过性表达,表达产物具有生物活性,但是无法实现NGF的稳定、长期表达，通常只作为瞬时表达宿主细胞。因此，在基因工程制药中,往往选择CHO细胞作为宿主细胞。利用CHO细胞表达外源基因有利于二硫键形成的细胞环境。该表达系统拥有完备的转录后加工过程,包括糖基化、羧基化,使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性,并且哺乳动物细胞能够使其表达产物分泌到胞外的培养基中,有利于外源蛋白的分离纯化(陈勇，人β-NGF真核表达载体的构建及其表达产物的生物活性，中国生物制品学杂志，2005，6(18),457-461.)。专利201210206171.0基于CHO细胞表达系统制备的人重组神经细胞生长因子纯化后比活大于5×105U/mg。因此国内外许多研究机构都采用CHO细胞表达系统表达了重组人NGF，活性测定结果表明，与鼠源性NGF相比，重组人NGF具有良好的生物活性。但是表达产物的生物学活性和表达水平是制约重组NGF产业化开发的关键因素和难点，且文献报道的CHO细胞的表达水平较低，较难筛选到高表达细胞株,最高才达到10mg/L左右，难以实现产业化开发(CountsSE,MufsonEJ.Theroleofnervegrowthfactorreceptorsincholi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达重组人神经生长因子的表达载体，其特征在于所述表达载体包括：如SEQ ID NO.1所述的重组人神经生长因子基因，和慢病毒表达载体‑pLX‑puromycin。

【技术特征摘要】
1.一种表达重组人神经生长因子的表达载体，其特征在于所述表达载体包括：如SEQIDNO.1所述的重组人神经生长因子基因，和慢病毒表达载体-pLX-puromycin。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达载体还包括表达N端带有6×His标签目的蛋白的HA-His标签，所述标签用于纯化。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达载体的结构如图3所示。4.一种表达重组人神经生长因子的真核细胞表达体系，其特征在于含有权利要求1所述的表达载体和CHO细胞。5.一种重组人神经生长因子的制备方法，包括：1)将重组人神经生长因子基因可操作地连接于pLX-puromycin慢病毒载体，构建如权利要求1所述的重组表达载体；2)将步骤1)构建的重组表达载体进行病毒包装；3)将步骤2)所述的病毒转染宿主细胞，培养收集病毒颗粒；4)将步骤3)所述病毒颗粒转导CHO细胞，构建表达重组人神经生长因子的真核细胞表达体系；5)培养步骤4)的所述的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王妍，黄志立，蒋伟，
申请(专利权)人：深圳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44