用于使DNA片段化的方法和试剂盒技术

提供了DNA片段化的方法。所述方法包括用对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域‑定向的核酸酶孵育包含DNA的半固体生物样品，以得到目的DNA片段，从而使DNA片段化。

Methods and kits for the fragmentation of DNA

The method of DNA fragmentation is provided. The method includes incubating semisolid biological samples containing DNA with the predefined loci of the DNA, which combines affinity and selectivity with the ancillary domain oriented nuclease, in order to get the target DNA fragment, so that the DNA is fragmented.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使DNA片段化的方法和试剂盒专利
和背景本专利技术在其一些实施方案中涉及用于使DNA片段化的方法和试剂盒，其可进一步用于DNA测序、成像、扩增和克隆。长基因组序列、特别是包含大的基因簇的那些的克隆对于产生药物和生物燃料的合成生物学和基因工程工作特别重要。传统的基于PCR的克隆方法通常受限于DNA模板的长度和GC含量：标准的PCR反应常规产生至多10kb的片段，而更长的PCR产物需要反应条件的繁琐优化，并且甚至在理想条件下，通常受限于35kb5。或者，可通过装配多个短片段，例如重叠PCR产物或化学合成的DNA寡聚物，产生长的目的基因组序列，但这样的方法趋于耗时和昂贵，特别是对于获得长于50kb的序列(其通常需要3-5阶段，每个包含多个装配事件)6,7。获得长的基因组序列的另一方法是通过基因组DNA的限制性酶消化。然而，作为一种非靶向的方法，从巨大量的限制性消化产物中选择特定目的序列可能是剧烈挑战和不方便的8。某些技术，例如转化关联的重组9,10和单链重叠退火11已被开发以克隆特定的大的细菌基因簇。然而，这些技术的利用仍受到限制，因为它们依赖于靶基因组区域侧翼的独特限制性位点的可用性，和通常靶序列中选择标记的存在。为了促进生物技术和合成生物学的进步，开发克隆几乎任意的长基因组序列(其使用常规方法难以获得)的通用方法势在必行。类似地，分离这样的几乎任意的长基因组序列将使得特异性靶向这些区域的基因组应用成为可能，所述应用例如超深或多路下一代测序、光学DNA作图和其它靶向基因组应用。CRISPR-Cas9，初始作为酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)适应性免疫系统的组分被发现，包含Cas9内切核酸酶，其可通过指导RNA定向切割特定序列12。其长的可编程的识别位点(20bp)导致比传统限制性酶(具有限于6-8bp的固定识别位点)更高得多的靶向特异性和通用性，这已促进广泛开发基于Cas9的基因组体内编辑13。相比之下，Cas9系统的体外潜在应用尚未被充分研究；而是，它们主要聚焦于测试该酶的切割效率和序列识别特异性或处理短的序列14,15。另外的
技术介绍
包括：WO2013142578US20140357523。专利技术简述根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供了使DNA片段化的方法，所述方法包括用对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域-定向的核酸酶孵育包含DNA的半固体生物样品，以得到目的DNA片段，从而使DNA片段化。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供了克隆的方法，所述方法包括：(a)按本文所述使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；和(b)克隆所述目的DNA片段。根据本专利技术的一些实施方案，所述方法进一步包括在片段化之后和克隆之前，熔解半固体生物样品。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供了DNA测序的方法，所述方法包括：(a)按本文所述使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；(b)从DNA分离所述目的DNA片段；和(c)测序所述目的DNA片段。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供了核酸扩增的方法，所述方法包括：(a)按本文所述使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；(b)从DNA分离所述目的DNA片段；和(c)扩增所述目的DNA片段。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供了原位成像DNA的方法，所述方法包括：(a)按本文所述使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；(b)从DNA分离所述目的DNA片段；(c)连接标记试剂至目的DNA片段；和(d)使目的DNA片段进行适合于检测标记试剂的成像方法。根据本专利技术的一些实施方案，目的DNA片段长度是50-150kb。根据本专利技术的一些实施方案，DNA是基因组DNA。根据本专利技术的一些实施方案，DNA是人DNA。根据本专利技术的一些实施方案，DNA是染色体DNA。根据本专利技术的一些实施方案，目的DNA片段包含基因簇。根据本专利技术的一些实施方案，半固体生物样品呈凝胶的形式。根据本专利技术的一些实施方案，半固体生物样品阻止DNA剪切。根据本专利技术的一些实施方案，从DNA分离所述目的DNA片段通过以下至少一项来实现：(a)熔解半固体生物样品；和(b)使半固体生物样品进行酶处理，所述酶处理消化半固体生物样品的凝胶基质。根据本专利技术的一些实施方案，从DNA分离所述目的DNA片段包括脉冲场凝胶电泳。根据本专利技术的一些实施方案，克隆通过Gibson装配实现。根据本专利技术的一些实施方案，所述方法进一步包括在片段化之前，在半固体生物样品中提供包含染色体DNA的细胞和裂解所述细胞。根据本专利技术的一些实施方案，所述方法进一步包括在片段化之后评估DNA的片段化效率。根据本专利技术的一些实施方案，评估片段化效率通过脉冲场凝胶电泳实现。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供了用于DNA片段化的试剂盒，所述试剂盒包含：(i)包含辅助结构域-定向的核酸酶的第一容器；(ii)包含低熔解凝胶基质的第二容器；和任选地(iii)包含细胞裂解缓冲液的第三容器。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供了用于DNA克隆的试剂盒，所述试剂盒包含按上文所述的组分和包含用于Gibson装配的外切核酸酶的另外的容器。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供了用于DNA扩增的试剂盒，所述试剂盒包含按上文所述的组分和包含聚合酶的另外的容器。根据本专利技术的一些实施方案，试剂盒包含上文所述的组分和包含标记试剂的另外的容器。根据本专利技术的一些实施方案，辅助结构域-定向的核酸酶是寡核苷酸-定向的核酸酶。根据本专利技术的一些实施方案，寡核苷酸-定向的核酸酶选自Cas和RISC。根据本专利技术的一些实施方案，Cas包含Cas-9。除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于实践或测试本专利技术的实施方案，但下文描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，和不意图必然是限制性的。附图简述本专利技术的一些实施方案在本文仅通过实例的方式，参考附图进行描述。现在详细地特别提及附图，应强调所示的具体细节为通过实例的方式，和为说明性论述本专利技术的实施方案的目的。在此方面，伴随附图的描述使得本领域技术人员对可如何实施本专利技术的实施方案显而易见。在附图中：图1是通过染色体区段的CRISPR-Cas9-辅助靶向(CATCH)的一步大基因簇克隆的示意图。在细菌细胞的凝胶内裂解后，染色体通过RNA-指导的Cas9在指定的靶位点处切割。在两个末端处与靶DNA共有30bp末端序列重叠(黑色十字)的克隆载体(长度未按比例)，在Gibson装配混合物中与靶片段连接。重组质粒然后被电转化至克隆宿主。图2A-G描述了通过CATCH，具有不同长度的长基因组序列的克隆。图2A–总共5个sgRNA对(SEQIDNOs:3-13)经设计以靶向大肠杆菌基因组中不同长度的片段(分别为50、75、100、150和200kb)，全都包含lacZ基因。图2B-琼脂糖凝胶块中的大肠杆菌染色体被具有相应的sgRNA对的Cas9消化，和通过PFGE分析。图2C-具有不同插入物大小的CATCH克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
使DNA片段化的方法，所述方法包括用对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域‑定向的核酸酶孵育包含DNA的半固体生物样品，以得到目的DNA片段，从而使DNA片段化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.04 US 62/1564171.使DNA片段化的方法，所述方法包括用对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域-定向的核酸酶孵育包含DNA的半固体生物样品，以得到目的DNA片段，从而使DNA片段化。2.克隆的方法，所述方法包括：(a)根据权利要求1使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；和(b)克隆所述目的DNA片段。3.权利要求2的方法，进一步包括在所述片段化之后和所述克隆之前，熔解所述半固体生物样品。4.DNA测序的方法，所述方法包括：(a)根据权利要求1使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；(b)从DNA分离所述目的DNA片段；和(c)测序所述目的DNA片段。5.核酸扩增的方法，所述方法包括：(a)根据权利要求1使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；(b)从DNA分离所述目的DNA片段；和(c)扩增所述目的DNA片段。6.原位成像DNA的方法，所述方法包括：(a)根据权利要求1使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；(b)从DNA分离所述目的DNA片段；(c)连接标记试剂至目的DNA片段；和(d)使目的DNA片段进行适合于检测所述标记试剂的成像方法。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述目的DNA片段长度是50-150kb。8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述DNA是基因组DNA。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述DNA是人DNA。10.权利要求8-9中任一项的方法，其中所述DNA是染色体DNA。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述目的DNA片段包含基因簇。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述半固体生物样品呈凝胶的形式...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱听，Y埃本斯泰恩，娄春波，姜文君，赵学金，T加布里伊里，
申请(专利权)人：特拉维夫大学拉莫特有限公司，清华大学，中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：以色列,IL