用于HIV感染的RNA导向治疗的方法和组合物技术

用于特异性裂解逆转录病毒中靶标序列的组合物，包括编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶的核酸、以及与逆转录病毒基因组中一个或多个靶标核酸序列互补的导引RNA序列。

Methods and compositions for RNA guided therapy for HIV infection

A composition for a sequence of targets in a specific lysis retrovirus, including nucleic acid of a short palindromic repeat sequence (CRISPR) related nucleic acid endonucleases that encodes a cluster law interval, and a guide RNA sequence that complements one or more target nucleic acid sequences in the retroviral genome.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于HIV感染的RNA导向治疗的方法和组合物关于联邦资助研究的声明本专利技术受到美国政府支持，在美国国立卫生研究院(NIH)给予KamelKhalili(P30MH092177)和WenhuiHu(R01NS087971)的资助下完成。美国政府可享有本专利技术的某些权利。
本专利技术涉及特异性裂解逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)中靶标序列的组合物和方法。该组合物可包括编码成簇规律性间隔短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspaceShortPalindromicRepeat,CRISPR)相关的核酸内切酶的核酸、以及与人免疫缺陷病毒中靶标序列互补的导引RNA序列，可给药至被HV感染或处于接触HIV感染风险下的受试者。
技术介绍
自发现HIV-1发现以来的三十多年里，AIDS一直是主要的公共健康问题，全世界范围内，超过3530万人受其影响。由于HIV-1永久性整合入宿主基因组中，AIDS仍然保持不可治愈。目前，用于控制HIV-1感染并深刻阻碍AIDS发展的疗法(高活性抗逆转录病毒疗法或HAART)降低了细胞内支持HIV-1感染的病毒复制，并将血浆病毒血症降低至最低水平。但HAART无法成功阻抑组织内低水平的病毒基因组表达和复制，且无法成功地以被潜在感染的作为HIV-1蓄积池的细胞，例如，静息记忆T细胞、脑巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞、以及肠相关淋巴样细胞为靶标。持续性HIV-1感染也与副发病变有关联，该副发病变包括心脏病和肾病、骨量减少、及神经障碍。对于以持续性病毒蓄积池为靶标的治愈性治疗策略存在持续需求。目前，用于控制HIV-1感染并防止AIDS进展的疗法已经急剧降低了易受HIV-1感染的细胞中的病毒复制，但并未消除含有HIV-1前病毒DNA整合复本的潜在被感染细胞中的低水平的病毒复制。亟需发展以持续性病毒蓄积池为靶标的治愈性治疗策略，包括自宿主细胞的基因组根除前病毒DNA的策略。近年来，已经研发出根除包括归位核酸内切酶(HE)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)、及CRISPR相关系统9(Cas9)蛋白在内的内源基因的若干新颖系统。在CRISPR方法中，,基因编辑复合体被组装，包括Cas9核酸酶和与靶标病毒DNA序列互补的导引RNA(gRNA)。该gRNA引导该Cas9核酸酶与含有该靶标序列的病毒DNA链啮合，并裂解该病毒DNA链。Cas9/gRNA基因编辑复合体经一个或多个突变引入该病毒DNA中。使用HE从遗传学角度打断被整合的HIV-1前病毒以将所保全的病毒蛋白序列作为靶标的可行性已有报导。以HIV-1宿主共受CCR5基因为靶向的ZFN已经进入HIV/AIDS治疗的2期临床试验。实验中已经显示，TALEN有效地在预期位点裂解CCR5。Cas9/gRNA编辑复合体也已经被用来打断HIV-1进入共受体(CCR5、CXCR4)和前病毒结构性蛋白(Manjunathetal.,Viruses,14；5(11):2748-2766(2013)；Stoneetal.,Curr.Opin.HIVAIDS.8(3):217-223(2013)；Wangetal.,PLoSOne.26；9(12):e115987(2014))。然而，CCR5并非仅仅用于HIV-1感染的受体，其还具有多种其它细胞功能。
技术实现思路
本专利技术提供涉及治疗和预防逆转录病毒(尤其是人免疫缺陷病毒HIV感染)的组合物和方法。该组合物和方法攻击已经被整合入宿主细胞的基因组内的前病毒HIV。具体来说，本专利技术提供组合物，该组合物包括编码CRISPR相关的核酸内切酶的核酸序列、以及一种或多种编码gRNA的单离的核酸序列，其中，各gRNA与逆转录病毒基因组中的靶标序列互补。优选的具体例中，该组合物中包括两种gRNA，且各gRNA将Cas核酸内切酶导向被整合的逆转录病毒DNAHIVDNA中的不同靶标位点。将在切割位点之间延伸的DNA删除，造成该HIV基因组被部分或全部切除。最有效的gRNA组合包括一对gRNA，其中，一个gRNA以LTR区域中的一位点为靶标，而另一个以结构性基因中的一位点如gag或pol为靶标；以及一对gRNA，其中，两个gRNA均以LTR中的位点为靶标。本专利技术还提供一种通过将哺乳动物细胞暴露于包括一种或多种编码基因编辑复合体的单离的核酸的组合物，而令该细胞中的逆转录病毒失活的方法。该基因编辑复合体包括一CRISPR相关的核酸内切酶以及一种或多种gRNA，其中，各gRNA与该逆转录病毒中的靶标序列互补。本专利技术进一步提供一种医药组合物，用于令哺乳动物受试者体内被整合的逆转录病毒前病毒DNA失活。该组合物包括编码Cas核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种编码至少一种gRNA的单离的核酸序列，其中，该gRNA与前病毒逆转录病毒DNA如HIVDNA中的靶标序列互补。优选以该逆转录病毒基因组中不同位点为靶向的成对gRNA。该单离的核酸序列包括在至少一种表达载体中。本专利技术再进一步提供治疗被逆转录病毒如HIV感染的哺乳动物受试者的方法。该方法包括下述步骤：确认哺乳动物受试者被HIV感染，给药有效量的先前阐明的医药组合物，以及治疗该哺乳动物受试者的HIV感染。本专利技术还提供一种治疗方法，用以降低处于逆转录病毒(如，HIV)感染下的哺乳动物受试者的感染风险。该方法包括下述步骤：确认哺乳动物受试者处于HIV感染的风险下，给药有效量的先前阐明的医药组合物，以及降低哺乳动物受试者感染HIV的风险。本专利技术进一步提供一种用于治疗和预防HIV感染的试剂盒。该试剂盒包括测得量的组合物，该组合物包含至少一种编码CRISPR相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种编码一种或多种gRNA的核酸序列，其中，该gRNA与HIV中的靶标位点互补。或者，该试剂盒可包括一种或多种编码该核酸的载体。该试剂盒亦可含有包装材料、具有使用说明书的包装插页、无菌液体、注射器、及/或无菌容器。附图说明图1A显示酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)、单导引RNA(sgRNA)和前间区序列邻近基序(PAM)的图解，显示位于来自该NGG或NAG以及sgRNA序列的两条DNA链的第三个核苷酸处的切割位点。该sgRNA由含有20bp间区序列(种子序列或靶标序列)及12bp的CRISPRRNA(crRNA)、茎环(GAAA)和反式激活cRNA(tracRNA)构成。图1B显示表达spCas9的慢病毒载体(上图)和表达sgRNA的慢病毒载体(下图)的示意图。该慢病毒报告载体(上图)购自Biosettia，表达用于免疫检测的3xFlag、用于简易效价和FACS分析的红色报告荧光蛋白(RFP)、以及用于自裂解以阻止RFP对Cas9功能的潜在效果的T2A肽。该表达sgRNA的慢病毒载体是从Addgene载体(#50946)修饰而得，显示BbsI克隆位点和抗生素选择标记物嘌呤霉素(Puromycin)以及用于简易效价和FACS分析的蓝色报告荧光蛋白(BFP)。图1C显示HIV-1基因组的图解，显示所选择的以HIV-1LTR的Gag(A至D)和Pol(A、B)区域为靶向的gRNA。图1D显示以HIV-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，用于令整合至潜在感染逆转录病毒的宿主细胞的基因组中的逆转录病毒DNA失活，该组合物包含：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，且所述gRNA与被整合的逆转录病毒DNA中的靶标序列互补，其中，该逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.01 US 62/169,384;2015.06.02 US 62/169,633;1.一种组合物，用于令整合至潜在感染逆转录病毒的宿主细胞的基因组中的逆转录病毒DNA失活，该组合物包含：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，且所述gRNA与被整合的逆转录病毒DNA中的靶标序列互补，其中，该逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA包括至少一种与被整合的逆转录病毒DNA中的靶标序列互补的第一gRNA；以及与被整合的逆转录病毒DNA中另一靶标序列互补的第二gRNA，藉此移除两个gRNA之间的介入序列。3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述靶标核酸序列包含HIV基因组的编码及非编码核酸序列中的一个或多个核酸序列。4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述靶标核酸序列包含HIV中的一个或多个核酸序列，所述核酸序列包含：长端重复序列(LTR)核酸序列、以及编码结构性蛋白、非结构性蛋白或其组合的核酸序列。5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述编码结构性蛋白的序列包含编码Gag、Gag-Pol前体、Pro(蛋白酶)、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env或其组合的核酸序列。6.如权利要求4所述的组合物，其中，所述编码非结构性蛋白的序列包含编码调节蛋白、辅助蛋白或其组合的核酸序列。7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述调节蛋白包含Tat、Rev或其组合。8.如权利要求6所述的组合物，其中，所述辅助蛋白包含Nef、Vpr、Vpu、Vif或其组合。9.根据权利要求3所述的组合物，其中，靶标核酸序列包含人免疫缺陷病毒(HIV)前病毒DNA的长端重复序列(LTR)区域的一个或多个序列、以及HIV整合DNA的结构性及/或非结构性基因中的一个或多个靶标；或者，第二基因中的一个或多个靶标；或者，第一基因中的一个或多个靶标以及第二基因中的一个或多个靶标；或者，第一基因中的一个或多个靶标、第二基因中的一个或多个靶标、及第三基因中的一个或多个靶标；或者，第二基因中的一个或多个靶标、以及第三或第四基因中的一个或多个靶标；或其任何组合。10.根据权利要求3所述的组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNO:1至SEQIDNO:57的序列一致性为至少75％。11.根据权利要求10所述的组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:57。12.一种令哺乳动物细胞中被整合的逆转录病毒DNA失活的方法，包括下述步骤：将所述细胞暴露于组合物，所述组合物包含至少一种编码包含成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的基因编辑复合体的单离的核酸序列、以及至少一种与所述被整合的逆转录病毒DNA中的靶标核酸序列互补的导引RNA(gRNA)；表达该基因编辑复合体；以及，令该所述被整合的逆转录病毒DNA失活。13.如权利要求12所述的方法，其中，所述被整合的逆转录病毒DNA是人免疫缺陷病毒(HIV)DNA，所述至少一种单离的核酸序列编码与HIVDNA的LTR区域中的靶标核酸序列互补的第一gRNA、以及与所述HIVDNA的结构性基因中的靶标核酸序列互补的第二gRNA。14.如权利要求12所述的方法，其中，gRNA核酸序列包含序列，所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:57的序列一致性为至少75％。15.根据权利要求14所述的方法，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:57。16.一种用于令哺乳动物受试者的被整合的逆转录病毒DNA失活的医药组合物，包括：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列；至少一种编码导引RNA(gRNA)的单离的核酸序列，所述gRNA与逆转录病毒DNA中的靶标序列互补；所述单离的核酸序列包括于至少一种表达载体中。17.如权利要求16所述的医药组合物，其中，所述被整合的逆转录病毒DNA是人免疫缺陷病毒(HIV)DNA，且所述至少一种gRNA包括与HIVDNA中的第一靶标序列互补的第一gRNA、以及与所述HIVDNA中的第二靶标序列互补的第二gRNA。18.如权利要求16所述的医药组合物，其中，所述第一靶标序列位于HIVDNA的LTR区域，以及，所述第二靶标序列位于所述HIVDNA的结构性基因中。19.如权利要求16所述的医药组合物，其中，gRNA核酸序列包含序列，所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:57的序列一致性为至少75％。20.如权利要求19所述的医药组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:57。21.一种治疗感染人免疫缺陷病毒(HIV)的哺乳动物受试者的方法，包括下述步骤：确定哺乳动物受试者HIV感染，给药有效量的根据权利要求16所述的医药组合物，以及治疗所述哺乳动物受试者的HIV感染。22.一种治疗处于人免疫缺陷病毒(HIV)感染风险下的哺乳动物受试者以降低其感染风险的方法，包括下述步骤：确定哺乳动物受试者处于HIV感染的风险下，给药有效量的根据权利要求16所述的医药组合物，以及降低所述哺乳动物受试者感染HIV的风险。23.一种用于治疗或预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染的试剂盒，包括测得数量的包含至少一种编码CRISPR相关的核酸内切酶的单离的核酸序列以及一种或多种导引RNA(gR...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·哈利利，W·胡，Y·张，
申请(专利权)人：天普大学联邦高等教育系统，
类型：发明
国别省市：美国,US