本发明专利技术公开了一种载基因的多功能造影剂,包括脂质壳膜,脂质壳膜上修饰有叶酸,脂质壳膜表面带有正电荷,且携载有基因。本发明专利技术要解决的技术问题是提供一种具有在体内外的靶向能力,具有增强超声/光声显影的能力,且具有体内外在激光作用下基因转染优势的一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用。
Preparation method and application of multifunctional gene contrast agent
The invention discloses a multifunctional contrast agent carrying gene, including a lipid shell membrane, a lipid shell membrane modified with folic acid, a positive charge on the surface of the lipid shell membrane, and carrying a gene. The technical problem to be solved is to provide a method for the preparation and application of a multifunctional contrast agent for gene transfection, which has the ability to target in vivo and in vivo, has the ability to enhance ultrasound / photoacoustic development, and has the advantage of gene transfection under the action of laser in the body and the body and the body.
【技术实现步骤摘要】
一种载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用
本专利技术涉及超声影像领域,具体涉及一种载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用。
技术介绍
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤,多发生于3岁以内,其恶性程度高,早期发现诊断困难。目前在中国,大多数患儿因“白瞳症”就诊时RB生长已较大,预示着已进入了严重危害视力甚至生命的时期,可能无法保住眼球,治疗仍以患眼眼球摘除为主,辅以放疗、化疗等手段。眼球摘除手术使患儿丧失了一眼视功能,永远不再有立体视觉,且严重影响患儿外观及身心健康;而放化疗均有较明显的毒副作用,放疗还可导致继发性肿瘤发生,治疗效果均不理想。因此早期特异性诊断RB以及采取有效治疗方案,对于能否保住患儿眼球、避免视功能丧失以及远期转移显得尤为重要。目前,临床对RB的常用检查手段包括眼科常规眼底检查、眼部B超、CT成像和MRI成像,这些传统的影像学技术还远不能做到早期特异性诊断RB和实时监控肿瘤治疗效果。新兴的分子影像学借助于分子探针技术,通过靶向结合或酶学激活等原理,从分子水平或信号通路水平进行精准的分子显像。而其中超声分子显像与治疗技术因其无创、简便、靶向性好等优势有望成为肿瘤诊断与治疗的主流方式,具有潜在的广阔临床应用前景,且更加适用于婴幼儿。超声分子成像主要通过微泡造影剂在感兴趣区靶向聚集实现靶向显影,但微泡造影剂用于分子显像存在一些致命的缺点,比如:微泡造影剂粒径为微米级,不能穿过血管内皮细胞间隙,使得研究只能局限于血管内,不能到达血管外肿瘤细胞靶标。近年来,关于RB的自杀基因治疗引起关注,单纯疙疹病毒胸昔激酶/丙氧鸟昔系统(HSV-TK/GCV)研究最为深入,也最具有应用前景。超声靶向破坏微泡(UTMD)介导的基因治疗因其安全、无创、简便易行等优点受到广大研究者关注,尤其阳离子微泡的诞生,使得基因携载量增多,基因转染效率有所升高。但微泡粒径为微米级,难以穿过血管内皮达到组织间隙,限制了其进一步应用。以液态氟碳为内核的相变型纳米粒微球近年来备受关注,这种纳米级微球能渗透血管到达组织。液态核增强超声显影的方式为聚集显影,其超声显影效果受限,一旦液态氟碳内核被触发变为气相,其超声显影将大大增强。研究者通常采用低频治疗超声或高强度聚焦超声辐照促进液态氟碳核发生相变,也被称作声致相变(ADV)。然而,拉普拉斯压力及表面稳定剂的应用致使超声触发微球相变相对困难,因此传统诊断超声的压力及频率不足以激发微球相变,促发微球相变需要的超声压力及频率也可能会导致不良的生物效应。目前,光致相变(ODV)的发展为我们带来了新的选择。将吸光材料(光吸收子)与液态核结合起来,通过激光辐照来诱导全氟化碳纳米粒发生液气相变。当应用相对低能量的激光辐照时,光吸收子温度升高,会发生热弹性膨胀,从而产生普通的光声信号;但当激光能量超过一定的阈值,光吸收子产生的局部温度上升足以促发微球发生液气相变,这将产生较之前者强很多的瞬时非线性光声信号,而且微球变为气相后将带来优质的超声信号对比。光声成像是一种新兴的、基于生物组织内部光学吸收差异、以超声作媒介的生物光子成像方法,结合了纯光学成像的高对比度特性和纯超声成像的高分辨率及高穿透深度特性的优点。由此可见,激光在新型的光致相变(ODV)和光声成像中都发挥了重要的作用,以激光做为主要手段的诊疗一体化纳米材料体系是目前研究新方向。研究表明在合适的参数下,激光可有效改变细胞膜通透性,有利于基因向细胞内部转运,从而提高转染效率。由于眼部组织的特殊解剖结构(屈光介质的透明性),目前在临床上,RB的治疗方法之一就是激光光凝治疗。结合目前对于RB早期诊断、实时监控以及精准治疗的迫切需求,我们拟制备一种包裹光吸收子的和液态氟碳,并能载基因的多功能造影剂,在激光作用下通过光致相变和光声效应实现超声/光声双模态显像,同时实现基因的转运和转染。为尽量减少对周围正常细胞的影响,有必要直接针对RB细胞进行靶向显影与治疗,以获得更好的显影与治疗效果。叶酸受体在多数上皮源性的肿瘤细胞中高度表达,在正常细胞中几乎零表达。最新研究发现,叶酸受体同样表达于RB细胞,使其成为RB靶向显影与治疗的新方向。综上所述,本研究拟制备一种能够穿过肿瘤新生血管内皮间隙,进而靶向视网膜母细胞瘤细胞,并能携载基因的靶向阳离子相变型液态氟碳纳米造影剂,当其通过静脉注射以后,能够主动靶向聚集于视网膜母细胞瘤,在一定能量的激光作用下,纳米粒内的液态氟碳发生液气相变,产生微泡而增强光声/超声成像,同时在激光作用下促发基因转染,实现靶向基因治疗;达到靶向显像及治疗的目的,同时减轻全身毒副作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种具有体内外的靶向能力,具有增强超声/光声显影的能力,且体内外具有在激光作用下基因转染优势的一种载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用。为了解决上述技术问题,本专利技术提供如下技术方案:一种载基因的多功能造影剂,包括脂质壳膜,脂质壳膜上修饰有叶酸,脂质壳膜表面带有正电荷,且携载有基因。进一步,所述的脂质壳膜内部包裹有液态氟碳和吲哚菁绿。进一步,其粒径为380.1±5.9,粒径多分散指数PDI为0.149。进一步,其ZETA电位为13.4±1.4mV。进一步,其吲哚菁绿包封率为92.1±1.3%。采用本专利技术的一种载基因的多功能造影剂,Malvern仪器测得本专利技术的纳米粒粒径约380.1±5.9,本专利技术的纳米粒能够穿过肿瘤毛细血管内皮间隙(100nm-780nm),所以能够满足本专利技术对其粒径的要求;Malvern仪测得其Zeta电位为13.4±1.4mV,能够保证纳米粒的相对稳定性而不致快速沉淀。透射电镜观察单个FCNPI/pDNA纳米造影剂呈黑色球形结构,形态规则,经检测结果,纳米粒稳定性良好,未见明显聚集或沉淀,其粒径和电位在48小时内均无明显变化,这些特性都将有利于纳米粒顺利穿过肿瘤毛细血管内皮间隙而到达肿瘤细胞周围。流式细胞学检测到纳米粒造影剂表面修饰有叶酸,这为后续的靶向显影和精准治疗奠定了基础。激光共聚焦显微镜和凝胶电泳均证实本专利技术表面携载有基因。此外,当激光参数为808nm、1W/cm2、2min时,FCNPI/pDNA纳米造影剂发生了相变,显微镜下见相变后产生大量气泡,这为超声成像提供了保障。紫外分光光度计测得吲哚菁绿ICG包封率为92.1±1.3%,保证了光致相变及光声成像的发生。本专利技术FCNPI/pDNA纳米造影剂所使用的磷脂成分与生物有机体的细胞膜磷脂成分相同,对生物体无任何毒副作用。液态氟碳因具有良好的携氧能力,可用作血液替代品,而且液态氟碳能弥散溶解于血液通过呼气排出体外,而不参与体内的生物化学降解,生物稳定性良好。吲哚菁绿(ICG)是一种三碳菁染料,最大吸收波长805nm,常被用于眼底脉络膜血管造影,以及眼科术中对晶状体囊膜和视网膜内界膜染色,是美国联邦药物管理局批准的唯一人体可用的在近红外范围吸光能力强的染料,是发展临床可用的光声探针的最佳选择。细胞毒性检测结果也进一步印证了本专利技术的生物安全性。激光在透明介质中具有良好的穿透性,在眼病治疗中应用广泛,具有绝对的优势。液态氟碳PFP具有良好的光致相变特性,而ICG具有光声显像的特性,把PFP和ICG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种载基因的多功能造影剂,包括脂质壳膜,其特征在于:脂质壳膜上修饰有叶酸,脂质壳膜表面带有正电荷,且携载有基因。
【技术特征摘要】
1.一种载基因的多功能造影剂,包括脂质壳膜,其特征在于:脂质壳膜上修饰有叶酸,脂质壳膜表面带有正电荷,且携载有基因。2.根据权利要求1所述的一种载基因的多功能造影剂,其特征在于:所述的脂质壳膜内部包裹有液态氟碳和吲哚菁绿。3.根据权利要求2所述的一种载基因的多功能造影剂,其特征在于:其粒径为380.1±5.9,粒径多分散指数PDI为0.149。4.根据权利要求3所述的一种载基因的多功能造影剂,其特征在于:其ZETA电位为13.4±1.4mV。5.根据权利要求4所述的一种载基因的多功能造影剂,其特征在于:其吲哚菁绿包封率为92.1±1.3%。6.一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法,其特征在于:采用旋转蒸发-超声法。7.根据权利要求6所述的一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法,其特征在于:旋转蒸发-超声法的操作步骤如下:1)、溶解:先将二棕榈酰磷脂酰胆碱、叶酸修饰的聚乙二醇-(2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和Dc-胆固醇用有机溶剂溶解;2)、旋转蒸发:于...
【专利技术属性】
技术研发人员:周希瑗,武明星,邹宏密,
申请(专利权)人:重庆医科大学附属第二医院,
类型:发明
国别省市:重庆,50
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