PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种PIK3CA基因突变的检测体系及其试剂盒，试剂盒包括PCR检测液A、PCR检测液B和SYBR GreenI混合液；PCR检测液A包括用于检测PIK3CA基因第9外显子E542K和E545K位点的上下游引物A和肽核酸A，PCR检测液B包括用于检测PIK3CA基因第20外显子H1047R和H1047L位点的上下游引物B和肽核酸B。本发明专利技术的PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PIK3CA基因突变检测。

PIK3CA gene mutation detection system and its kit

The present invention relates to a detection system for PIK3CA gene mutation and its kit. The kit includes the PCR detection solution A, the PCR detection solution B and the SYBR GreenI mixture. The PCR detection liquid A includes the detection of the E542K and the E545K loci of the PIK3CA gene ninth. 20 the upstream and downstream primers B and PNA B of exons H1047R and H1047L sites. The PIK3CA gene mutation detection system and its kit have high sensitivity and specificity, and the sample demand is low, and the PIK3CA gene mutation detection can be carried out quickly, conveniently and accurately.

【技术实现步骤摘要】
PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测PIK3CA基因突变的方法和检测产品，属于生物

技术介绍
磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一种脂质激酶，参与细胞存活、运动、黏附和凋亡等多种细胞生理功能的调节，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。PIK3是由调节亚基p85和催化亚基p110组成的异源二聚体，PIK3CA基因编码Ⅰ类PI3Ks的p110α催化亚基。PIK3CA基因位于染色体3q26.3，其发生突变，会导致激酶活性增强，激活PI3K通路的下游AKT通路，减少细胞增值对于生长因子的依赖，增加肿瘤细胞的浸润和转移。PIK3CA基因的突变中约80％发生于在螺旋区(Exon9)和激酶区(Exon20)这两个热点区域。PIK3CA基因突变常发生在结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等肿瘤，其中结直肠癌中突变率为10-32％，乳腺癌中突变率为8-40％。大量临床研究报道表明，携带PIK3CA基因特定突变的患者对EGFR、HER2靶向药物治疗存在耐药性。本专利技术可用于体外人类PIK3CA基因外显子9和20的常见突变E542K、E545K、H1047R和H1047L的定性检测，为临床确诊的结直肠癌和乳腺癌患者的PIK3CA基因突变状态提供定性评估。目前进行PIK3CA基因突变检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测PIK3CA基因突变的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的PIK3CA基因突变检测是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PIK3CA基因突变检测的PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种PIK3CA基因突变检测体系，包括用于检测PIK3CA基因第9外显子E542K和E545K位点的上下游引物A，用于检测PIK3CA基因第20外显子H1047R和H1047L位点的上下游引物B；包括荧光染料SYBRGreenI和肽核酸；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述肽核酸包括核苷酸序列与PIK3CA野生型基因第9外显子E542K和E545K位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸A，以及核苷酸序列与PIK3CA野生型基因第20外显子H1047R和H1047L位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸B。上述上下游引物A、B进行了LNA修饰。上述上下游引物A、B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L。上述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L。上述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。上述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1.25μM/L。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述检测体系的PIK3CA基因突变检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种PIK3CA基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液A、PCR检测液B和SYBRGreenI混合液；所述PCR检测液A包括用于检测PIK3CA基因第9外显子E542K和E545K位点的上下游引物A和肽核酸A，所述PCR检测液B包括用于检测PIK3CA基因第20外显子H1047R和H1047L位点的上下游引物B和肽核酸B；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。所述肽核酸包括核苷酸序列与PIK3CA野生型基因第9外显子E542K和E545K位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸A，以及与PIK3CA野生型基因第20外显子H1047R和H1047L位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸B。上述上下游引物A、B进行了LNA修饰；所述上下游引物A、B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。上述PIK3CA基因突变检测试剂盒，还包括阳性对照P1、阳性对照P2和阴性对照；所述阳性对照液P1是浓度为100ng/μL的包含PIK3CA基因第9外显子E542K和E545K位点和第20外显子H1047R和H1047L位点的野生型质粒溶液；所述阳性对照液P2是浓度为100ng/μL的包含PIK3CA基因第9外显子E542K和E545K位点和第20外显子H1047R和H1047L位点的突变型质粒溶液；所述阴性对照液是不含PIK3CA基因的基因组DNA溶液。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术采用PNA钳制实时定量PCR检测法，仅需通过熔解曲线分析，即可将PIK3CA基因突变型与野生型区分开。通过一步反应，可解决PCR扩增、突变富集及定量整个过程，无需诸如电泳、杂交、酶切等后续步骤，大大简化了实验过程，整个反应过程在密封管内完成，最大限度地减少了污染的可能，降低假阳性率。(2)本专利技术的PIK3CA基因突变检测方法及其试剂盒，可同时检测第9、20外显子任意一种突变，灵敏度高。灵敏度可达到0.1％～0.5％，与常规PCR的浓度相比，本专利技术容易地检测出非常低浓度样本的PIK3CA常见突变位点的基因型，克服了TaqMan探针法需要使用多条特异性探针分别进行检测的缺点，满足大样本量临床筛查的要求。(3)本专利技术选择SYBRGreenI作为荧光染料，价格低廉，大大降低检测成本。附图说明图1采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的E542K和E545K野生型位点特异性产物峰Tm值。图2是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的H1047R和H1047L野生型位点特异性产物峰Tm值。图3是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P2的E542K和E545K突变型位点特异性产物峰Tm值。图4是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P2的H1047R和H1047L突变型位点特异性产物峰Tm值。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。一、试剂盒的组成。本实施例的PIK3CA基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液A、PCR检测液B、SYBRGreen本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测PIK3CA基因第9外显子E542K和E545K位点的上下游引物A，用于检测PIK3CA基因第20外显子H1047R和H1047L位点的上下游引物B；包括荧光染料SYBRGreen

【技术特征摘要】
1.一种PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测PIK3CA基因第9外显子E542K和E545K位点的上下游引物A，用于检测PIK3CA基因第20外显子H1047R和H1047L位点的上下游引物B；包括荧光染料SYBRGreen和肽核酸；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述肽核酸包括核苷酸序列与PIK3CA野生型基因第9外显子E542K和E545K位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸A，以及核苷酸序列与PIK3CA野生型基因第20外显子H1047R和H1047L位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸B。2.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物A、B进行了LNA修饰。3.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物A、B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L。4.根据权利要求3所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L。5.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。6.根据权利要求5所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1.25μM/L。7.一种采用如权利要求1所述的检测体系的PIK3CA基因突变检测产品。8.一种PIK3CA基因突变检...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵国玲，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31