本发明专利技术涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。具体而言，本发明专利技术公开了一种二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还同时公开了编码上述二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述；或者与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。本发明专利技术的蛋白可以进入水稻重要害虫二化螟幼虫的重要免疫相关细胞——颗粒血细胞中。
CcCRT and its application in the secretion of calreticulin from glands and ovaries of the parasitoids of Chilo suppressalis
The invention relates to the fields of molecular biology, genetic engineering and protein engineering. Specifically, the invention discloses a calreticulin CcCRT secreted from the venom glands and ovaries of the Striped stem borer, Chilo suppressalis, whose amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:2. The present invention also discloses the gene encoding the caonet protein CcCRT secreted by the venomous gland and the ovary of the ovary. The nucleotide sequence is described by the SEQ ID NO:1, or at least 70% homology with the nucleotide sequence in the SEQ ID NO:1, or the nucleotide sequence can be with SEQ ID NO:1 under the condition of SEQ. Hybridization in the nucleotide sequence. The protein of the invention can enter into the important immune related cells of the rice important pest, Chilo suppressalis larvae, which are granular blood cells.
【技术实现步骤摘要】
二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT及其应用
本专利技术涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT及其编码的核酸序列及应用。
技术介绍
农业害虫是农业增产和农产品质量提高的重要制约因素，据统计，我国每年因病虫害损失的粮食近500亿斤，经济作物损失达350多亿斤。长久以来，化学农药的大量不合理使用导致农药残留、害虫抗性以及再猖獗等问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，害虫防治迎来新的契机。据统计，全球转基因种植面积由1996年的约170万公顷猛增到2014年的1.8亿公顷(其中抗虫的占43％)，产生了明显的经济与生态效应。然而，长期单一种植Bt基因抗虫作物，靶标害虫的抗性问题也日益浮现。因此，科研工作者也致力于从微生物、植物和动物中挖掘新型杀虫蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段，培育新型抗虫转基因作物，以其解决上述农药和Bt作物带来的问题。寄生蜂是一类重要的天敌昆虫，有着重要的生防价值。寄生蜂携带多种寄生因子，包括毒液(venom)、卵巢分泌蛋白(ovarianfluids)、多分DNA病毒(polydnavirus)、类病毒颗粒(virus-likeparticle)、畸形细胞(teratocyte)等。这些寄生因子可以调节寄主免疫反应、生长发育等生理活动。对于寄生蜂寄生因子的研究可以服务生产，开辟害虫生物防治的新途径。例如藏红足侧沟茧蜂(Microplitiscroceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因转入烟草，可提高植株对烟草天蛾(Manducasexta)的抗性等。二化螟Chilosuppressalis，属鳞翅目草螟科(Lepidoptera:Crambidae)，是我国水稻上的重要钻蛀性害虫之一，可造成水稻枯心和白穗等。该虫分布广，适应性强。中国稻螟年发生面积1500万公顷以上，总经济损失约115亿元。二化螟盘绒茧蜂(Cotesiachilonis)属膜翅目茧蜂科(Hymenoptera:Braconidae)，主要分布于中国的贵州、江苏、浙江、江西、湖南、四川、福建、广东、广西、云南和台湾等地，也分布于印度尼西亚、日本和朝鲜等亚洲国家。该蜂是二化螟幼虫期优势多寄生性的内寄生蜂，例如在江苏越冬代寄生率可达90％，水稻生长期其寄生率为10％-30％，该寄生蜂的寄生因子包括毒液、卵巢分泌蛋白和畸形细胞，对其寄生因子具体组分的研究和挖掘具有重要的生产实践意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以进入水稻重要害虫二化螟免疫相关细胞(颗粒血细胞)的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白基因CcCRT及其编码的蛋白质和用途。为解决技术问题，本专利技术提供了一种二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。备注说明：SEQIDNO：2包含了信号肽，为：MRALVAILAIAVIATVSA。作为本专利技术的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的改进：该蛋白、其保守性变异蛋白、其活性片段或其活性衍生物。本专利技术还同时提供了编码上述二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：1所述；或者与SEQIDNO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQIDNO：1中的核苷酸序列杂交。作为本专利技术的基因的改进：序列中包含SEQIDNO.1中8～66个连续核苷酸。本专利技术还同时提供了上述二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的用途：该蛋白和GFP蛋白融合表达能进入寄主二化螟幼虫颗粒血细胞。本专利技术所提供的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT蛋白及编码它的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和生物农药并应用于农业害虫防治等多个领域。本专利技术具体是通过以下技术方案实现的：本专利技术利用二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢转录组测序获得了钙网蛋白CcCRT基因全部序列，对提取的二化螟盘绒茧蜂毒腺的RNA进行反转录得到cDNA，进行分子克隆、真核表达和非变性条件下纯化，真核表达的EGFP-CcCRT(GFP和CcCRT融合表达)都能够进入农业害虫二化螟幼虫的颗粒血细胞的功能。本专利技术所分离出的DNA分子包括：编码具有二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQIDNO：1中的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的蛋白。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO：1中的核苷酸序列。本专利技术分离出的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT包括：具有SEQIDNO：2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该蛋白是具有SEQIDNO：2序列的蛋白。本专利技术DNA分子包含所述的DNA分子中8-66个连续核苷酸。本专利技术DNA分子转化的宿主细胞是昆虫细胞。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT编码的核酸序列指：编码具有二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT活性的蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO：1中的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，SEQIDNO：1序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO：1中的核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQIDNO：1所述的序列。还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQIDNO：1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQIDNO：1中的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的二化螟盘绒毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT相同功能的蛋白的SEQIDNO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本专利技术中二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT蛋白指：具有二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT活性的SEQIDNO：2序列的蛋白。该术语还包括具有与天然二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT相同功能的SEQIDNO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内本文档来自技高网...
【技术保护点】
二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT，其特征是：其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT，其特征是：其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。2.根据权利要求1所述的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT，其特征是：所述蛋白为该蛋白、其保守性变异蛋白、其活性片段或其活性衍生物。3.编码如权利要求1或2所述的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的基因，其特征是：其核苷酸序列为SEQIDNO：1所述；...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶恭银，滕子文，熊时姣，方琦，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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