包含别构转录因子调控系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途技术方案

本发明专利技术涉及包含别构转录调控系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途。

Biosensor, kit containing allosteric transcription factor regulatory system and its use in small molecule detection

The present invention relates to a biosensor, kit containing allosteric transcriptional regulatory system and its use in small molecule detection.

【技术实现步骤摘要】
包含别构转录因子调控系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途
本专利技术属于生物检测领域，涉及借助别构转录因子(allosterictranscriptionfactor，aTF)与DNA的相互作用，对样品中是否存在特定种类的小分子进行检测的体外(invitro)方法、试剂盒和设备。
技术介绍
对样品中小分子的有效检测对于环境污染监控、食品质量控制和疾病诊断等都极为重要。现有技术中的小分子检测方法主要分为两大类，理化分析方法和生物分析方法。理化分析方法主要通过波谱法、色谱法及其联用技术。这些技术分离效能高、选择性好、定性和定量能力强。然而，其样品制备过程复杂，仪器价格昂贵，耗时长。即便熟练的操作人员也需要较长时间才能获得结果，且不适用于现场分析。生物分析方法通常借助生物体内已有的小分子与蛋白/核酸的特异性相互作用，在较小的体系或芯片上实现信号的生成、放大、信号转换和读出。这样的方法能够实现现场、实时检测。特别地，现有技术通常模拟激动剂/拮抗剂-受体、或者抗原-抗体相互作用对，利用与小分子相互作用的受体或抗体对小分子进行抓取。或者，通过筛选获得能够与小分子发生特异性相互作用的核酸(例如适体)，实现对小分子的特异性识别。随后，通过抗体级联放大、石英晶体微量天平等方式，将此类相互作用的信号转化并放大为光/电信号，从而读出小分子是否存在和/或浓度的信息。然而，本领域所惯用的信号生成和换能元件并不能同时满足检测所需的灵敏度和特异性需求。特别是例如在使用最常用的一抗/二抗放大方式时，由于该放大过程为非定量，这样的方法大多仅能实现定性检测。此外，采用激动剂/拮抗剂-受体或者抗原-抗体作为识别元件所能够检测的小分子种类是有限的，某些疾病特异性指征或环境污染物并无相应的受体或抗体。为了获得更大的待检测物范围，已经提出利用真核或原核细胞自身的转录调控系统进行小分子检测。例如，在可被小分子诱导的启动子下游连入荧光蛋白，借助细胞自身的转录翻译机器进行信号放大，通过检测诱导曲线-荧光强度获得小分子的浓度的信息。此类方法可使用的识别元件为包括乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、水杨酸诱导型启动子等在内的转录调控系统。然而，上述方法均使用全细胞系统。由于荧光蛋白的生成与细胞的密度、生理状况等密切相关，上述方法的检测稳定性较差。另一方面，此类检测系统的检测下限不仅取决于诱导物与反式作用因子的相互作用，还受到细胞的转录机器的限制，诱导型启动子常常出现的渗透表达等问题使得检测下限的降低更加困难。就这一点而言，本领域仍然需要针对特定小分子的兼顾灵敏度和特异性、且可定量范围较宽的检测方法。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；以及所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。在第二方面，本专利技术提供了一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；以及所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。在第三方面，本专利技术提供了别构转录因子在制备用于检测小分子的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；以及所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。在第四方面，本专利技术提供了一种对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：(a)提供检测用溶液，所述检测用溶液包含识别元件以及换能元件，其中，所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；(b)将所述样品与所述检测用溶液混合；以及(c)对步骤(b)获得的混合物进行检测，其中，步骤(a)-(c)全部在液相实施。有益效果本专利技术利用别构转录因子与其靶DNA片段(包含该别构转录因子作用位点的DNA片段)以及效应物小分子的体外相互作用，将小分子的有无或浓度的信息转换为别构转录因子-靶DNA-小分子三者相互作用的结合信号，随后可通过多种本领域已知的简单的换能方式将该相互作用信号转化放大为可检测的光学信号等。本领域已知多种天然存在和人工改造的别构转录因子-靶DNA/效应物相互作用，也已知多种诱导和阻遏类型的基因调控系统元件。这些基因调控系统元件均可用于本专利技术。就这一点而言，本专利技术的方法能够实现针对多种效应物小分子，特别是针对酶-底物反应、受体-小分子反应或抗体-抗原反应所难以覆盖的小分子的检测，因此在生物医学研究、疾病诊断、环境监测和食品卫生检测等方面均具有广阔的应用和应用前景。另一方面，对于同时能够作为酶-底物方式和本专利技术的别构转录因子-效应物方式的检测对象的小分子而言，由于与酶-底物的平衡解离常数KD相比，别构转录因子-效应物的平衡解离常数数值相当或更低，本专利技术方法的检测灵敏度等同于甚至优于采用酶-底物机制的生物传感器。与现有技术的全细胞生物传感器(Wholecellbiosensor)不同的是，本专利技术传感器的识别和换能元件均为体外存在的非细胞体系，有效避免了细胞状态、密度和单细胞间差异对检测结果的干扰以及由于采用细胞转录机制作为换能元件造成的检测灵敏度不佳的问题。本专利技术采用能够产生相互作用的别构转录因子与DNA作为识别元件的优势还在于，能够与多种本领域中成熟完善且简单易行的换能和定量放大技术相结合，实现信号的转换与放大，使得小分子定量检测的敏感度、准确度均得到大幅度提升，且线性范围更宽、工作条件要求更低。例如，如本专利技术实施例所展示的，作为本专利技术一个实施方式的用于检测尿酸的生物传感器能够实现低至1nM的检测阈值，与现有的多种生物传感器相比，检测阈值降低10-125,000倍。特别地，本专利技术的识别元件和换能元件均以液相形式提供，本专利技术的检测方法和生物传感器也不涉及将识别元件或换能元件固定在固相表面，使得样品流经表面时发生可能的结合，再用流体将残留的样品带走的固相-液相相互作用。采用固相-液相相互作用的缺陷在于，被修饰在固相表面的识别元件和/或换能元件持续处于流体的静水压力下，常常会发生识别元件和/或换能元件部分脱离的现象，从而造成定量分析的不准确；而流体压力环境干扰小分子与识别元件的结合，降低了检测灵敏度。另外，固相-液相方式需要将蛋白和/或DNA修饰在固相表面，成本较高；虽然通过反复清洗的方式能够实现检测芯片的重复利用，然而，由于清洗很难完全彻底，也会出现检测结果不稳定或污染的问题。优选地，本专利技术的生物传感器的性能可通过对与别构转录因子作用的DNA片段的序列进行优化而进一步得到改善。本领域已知能够对与特定蛋白相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；以及所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；以及所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。2.如权利要求1所述的生物传感器，所述生物传感器进一步包含如下的任意一种或多种特征：所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量；所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物；所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍；所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍；所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。所述换能元件将所述别构转录因子、所述小分子与所述DNA片段之间相互作用的信号转换并放大为可检测的光信号；优选地，所述光信号是荧光信号或吸收光信号；所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物；所述换能元件选自于ALPHA供体珠和受体珠、纳米颗粒和量子点；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联；优选地，所述生物传感器进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子；或者，所述生物传感器进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端；优选地，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基；或者，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。3.一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与所述小分子的结合使得所述别构转录因子与所述DNA片段的结合亲和力升高或降低；以及所述识别元件和所述换能元件均以液相形式提供。4.如段落3所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含如下的任意一种或多种特征：所述小分子具有大于50道尔顿但小于5000道尔顿的分子量；所述小分子为重金属离子、药物、代谢物或污染物；所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍；所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录因子与所述小分子形成的复合物与所述DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍；所述DNA片段具有10-150bp，更优选10-80bp的长度。所述换能元件将所述别构转录因子、所述小分子与所述DNA片段之间相互作用的信号转换并放大为可检测的光信号；优选地，所述光信号是荧光信号或吸收光信号；所述换能元件为能量供体化合物和能量受体化合物；所述换能元件选自于ALPHA供体珠和受体珠、纳米颗粒和量子点；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自与所述DNA片段和所述别构转录因子相偶联；优选地，所述试剂盒进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用，所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段和所述第二蛋白，优选地，所述第二蛋白为与所述别构转录因子不同的第二转录因子；或者，所述试剂盒进一步包含第二换能元件，所述第二换能元件包含位于所述DNA片段上的第二位点以及第二蛋白，所述第二蛋白能够与所述第二位点相互作用；所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的5’末端，或者所述能量供体化合物和所述能量受体化合物各自连接至所述DNA片段的3’末端；优选地，所述第二蛋白为核酸外切酶，所述第二位点为所述DNA片段5’或3’末端的悬垂序列；优选地，所述悬垂序列为3-6个碱基、优选5个碱基；或者，所述第二蛋白为核酸内切酶，所述第二位点为所述DNA片段上的限制性酶切位点。5.别构转录因子在制备用于检测小分子的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含识别元件和换能元件，其中，所述识别元件由别构转录因子和DNA片段组成，所述DNA片段包含与所述别构转录因子作用的位点，所述别构转录因子与...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨克迁，王为善，李珊珊，范可强，李子龙，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11