一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗。本发明专利技术首先保护一种突变蛋白，是将流感病毒的NS1蛋白进行如下两个氨基酸残基的突变得到的：第38位氨基酸残基由精氨酸突变为丙氨酸，第41位氨基酸残基由赖氨酸突变为丙氨酸。本发明专利技术还保护一种重组病毒，是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：自N末端第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子突变为丙氨酸密码子，自N末端第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子突变为丙氨酸密码子。本发明专利技术还保护以上任一所述重组病毒在制备流感病毒疫苗中的应用。本发明专利技术对于流感病毒的防治具有重大应用价值。

A limited replicating mucosal immune vaccine for influenza virus

The invention discloses a limited replicating mucosal immune vaccine for influenza virus. The invention first protects a mutant protein that is derived from the mutation of the NS1 protein of the influenza virus as following two amino acid residues: the thirty-eighth amino acid residues are mutated from arginine to alanine and forty-first amino acid residues are mutated from lysine to alanine. The invention also protects a recombinant virus which is a recombinant virus obtained by the following mutation of the two amino acid residues encoding the NS1 protein in the influenza virus genome: the codon from the thirty-eighth - bit amino acid residue of the N terminal from the arginine codon to the alanine codon and the density of the forty-first - bit amino acid residues from the end of the N The codon is mutated from lysine codon to alanine codon. The invention also protects the application of any recombinant virus mentioned above in the preparation of influenza virus vaccine. The invention has great application value for the prevention and treatment of influenza virus.

【技术实现步骤摘要】
一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗
本专利技术涉及一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗。
技术介绍
流行性感冒病毒，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流行性感冒病毒(Influenzavirus)属的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒。人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行，例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感。乙型流感病毒对人类致病性较低。丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。甲型流感病毒的RNA由8个节段组成，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚集酶，第4个节段负责编码血凝素；第5个节段负责编码核蛋白，第6个节段编码的是神经氨酸酶；第7个节段编码基质蛋白，第8个节段编码的是一种未知功能的能起到拼接RNA功能的非结构蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗。本专利技术首先保护一种突变蛋白，命名为NS1R38A/K41A蛋白，是将流感病毒的NS1蛋白进行如下两个氨基酸残基的突变得到的：第38位氨基酸残基由精氨酸突变为丙氨酸，第41位氨基酸残基由赖氨酸突变为丙氨酸。编码所述突变蛋白的基因(命名为NS1R38A/K41A基因)也属于本专利技术的保护范围。NS1R38A/K41A基因具体可为将编码NS1蛋白的基因进行如下两组突变得到的：第112-114位核苷酸由“cga”突变为“GCA”，第121-123位核苷酸由“aag”突变为“GCA”。编码NS1蛋白的基因具体如序列表的序列1所示。含有NS1R38A/K41A基因的质粒也属于本专利技术的保护范围。所述质粒具体可为质粒pHH21-NS1R38A/K41A。质粒pHH21-NS1R38A/K41A为将NS1R38A/K41A基因插入载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)得到的重组质粒。本专利技术还保护一种重组病毒，是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：自N末端第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子突变为丙氨酸密码子，自N末端第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子突变为丙氨酸密码子。所述重组病毒具体可为：是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：自N末端第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子“cga”突变为丙氨酸密码子“GCA”，自N末端第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子“aag”突变为丙氨酸密码子“GCA”。所述重组病毒具体可为：是将流感病毒基因组中序列表的序列1所示的编码NS1蛋白的基因进行如下两组突变得到的：第112-114位核苷酸由“cga”突变为“GCA”，第121-123位核苷酸由“aag”突变为“GCA”。以上任一所述NS1蛋白为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由其衍生的蛋白质。本专利技术还保护一种重组病毒，其制备方法包括如下步骤：将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS1R38A/K41A、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP共转染离体哺乳动物细胞后进行培养得到的重组病毒。pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB2为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-HA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NP为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-M为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列9所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NS1R38A/K41A为将NS1R38A/K41A基因插入载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PA为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-NP为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述哺乳动物细胞具体可为293TRIG-IKO细胞。所述培养条件具体可为37℃培养6-72小时。本专利技术还保护一种制备流感病毒疫苗的方法，包括如下步骤：第1次传代的方法如下：将所述重组病毒感染哺乳动物细胞，培养后收集上清，即为含有F1代病毒的病毒液；第2次传代的方法如下：采用上一次传代得到的病毒液感染哺乳动物细胞，培养后收集的上清为含有F2代病毒的病毒液；重复按照第2次传代的方法进行连续传代；第N-1次传代中，收集的上清具有病毒复制能力；第N次传代中，收集的上清不具有病毒复制能力；N为3以上的自然数；将第N-1次传代收集的上清作为流感病毒疫苗的活性成分。本专利技术还保护一种制备流感病毒疫苗的方法(方法甲)，包括如下步骤：(1)将所述重组病毒感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F1代病毒液；(2)F1代病毒液感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F2代病毒液；(3)F2代病毒液感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F3代病毒液；(4)将F3代病毒液作为流感病毒疫苗的活性成分；本专利技术还保护一种制备流感病毒疫苗的方法(方法乙)，包括如下步骤：(1)将所述重组病毒感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F1代病毒液；(2)F1代病毒液感染A549细胞，培养后收集上清，即F2代病毒液；(3)将F2代病毒液作为流感病毒疫苗的活性成分。以上任一所述方法制备得到的流感病毒疫苗也属于本专利技术的保本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变蛋白，是将流感病毒的NS1蛋白进行如下两个氨基酸残基的突变得到的：第38位氨基酸残基由精氨酸突变为丙氨酸，第41位氨基酸残基由赖氨酸突变为丙氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种突变蛋白，是将流感病毒的NS1蛋白进行如下两个氨基酸残基的突变得到的：第38位氨基酸残基由精氨酸突变为丙氨酸，第41位氨基酸残基由赖氨酸突变为丙氨酸。2.编码权利要求1所述突变蛋白的基因。3.含有权利要求2所述基因的质粒。4.一种重组病毒，是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子突变为丙氨酸密码子，第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子突变为丙氨酸密码子。5.一种重组病毒，其制备方法包括如下步骤：将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS1R38A/K41A、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP共转染离体哺乳动物细胞后进行培养得到的重组病毒；pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB2为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-HA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NP为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-M为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列9所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NS1R38A/K41A为将权利要求2所述基因插入载体pHH21的多克隆位点得到的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晶，刘文军，陈璨，张爽，孙蕾，张瑞丰，范文辉，杨利敏，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11