用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒根据检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，建立了单管、同步检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的检测方法。本发明专利技术试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，可以同时进行大批量的样本分析，一次反应便能鉴别诊断样本是猪圆环病毒2型感染，或猪圆环病毒3型感染，或两者共同感染，为猪圆环病毒疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

Dual PCR primers, detection methods and kits for detection of porcine circovirus type 2 and circovirus type 3

The invention provides a dual PCR primer, a detection method and a kit for detecting porcine circovirus type 2 and circovirus type 3. The kit provides a double PCR primer for detecting porcine circovirus type 2 and a highly conservative specific sequence of circovirus type 3. The detection method of single tube, synchronous detection of porcine circovirus type 2 and circovirus type 3 was established. The kit has the characteristics of fast, simple, strong specificity, high sensitivity and good reliability. It can be used in large quantities of sample analysis at the same time. The diagnostic samples can be identified as porcine circovirus type 2 infection, or porcine circovirus type 3 infection, or both of them, to monitor and prevent the epidemic of porcine circovirus. Control provides strong technical support and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。
技术介绍
猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)为圆环病毒科圆环病毒属的一种小而无囊膜、二十面体对称、环状、共价闭合的单股DNA病毒。病毒粒子直径平均为17nm，以滚环方式进行复制，是目前发现的最小的无囊膜DNA病毒。Brain、Allan等认为可根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列可将猪圆环病毒分成两种基因型，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcinecircovirusassociateddiseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍症、增生性肠炎、坏死性间质性肺炎、仔猪先天性震颤等，表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。近来，一种新型的猪圆环病毒3型病毒在美国首次被报道，该病毒基因组全长2.0kb，其基因编码两个主要蛋白：Cap蛋白和Rep蛋白，两者在核酸链上处于相反方向，其能引起猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心脏和多系统炎症等症状。目前检测PCV的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及PCR检测等。但病毒分离、血清学检测方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。而PCR检测的方法主要以某一病毒类型的单一检测为主，不能进行多种病毒类型的联合PCR检测，并且检测灵敏性与特异性也参差不齐。由于PCV2和PCV3能引发猪圆环病毒相关疾病，若能建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的PCV2和PCV3联合检测鉴别方法，准确认别猪感染的病因并对症下药，对生猪养殖行业意义重大。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒，建立一种能够同时鉴别诊断PCV2和PCV3病毒的双重PCR检测方法，且具有很高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。本专利技术第一方面提供一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物，所述引物根据检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪圆环病毒2型的检测引物，由SEQIDNO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪圆环病毒3型的检测引物，由SEQIDNO：11所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：12所示的核苷酸序列的反向引物组成。上述的检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物在制备检测猪圆环病毒的制品中的应用。本专利技术第二方面提供一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品制备基因组总DNA；2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR反应体系总体积为50μl，包括：1)10μM的SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12所示核苷酸序列各1μl；2)10×ExPCRBμffer5.0μl；3)dNTPMixtμre4.0μl；4)ExTaqDNA聚合酶1.0μl；5)RNasefreeddH2032.0μl；6)待测样品的DNA模板4μl。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR反应条件包括：94℃预变性4min后进入循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环结束后；72℃终延伸10min。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR检测方法，其检测灵敏度可达102拷贝/μL。本专利技术第三方面提供一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR检测试剂盒，包括如本专利技术第一方面所述的检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物，还包括10×PCRbuffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、阳性质控品、阴性质控品。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR检测试剂盒可特异性检测鉴定猪圆环病毒2型和圆环病毒3型，不能检测出猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪蓝耳病病毒、猪三角冠状病毒中的一种或多种。本专利技术第四方面提供一种如本专利技术第一方面所述的双重PCR引物、如本专利技术第二方面所述的双重PCR检测方法或如本专利技术第三方面所述的双重PCR检测试剂盒在猪圆环病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。附图说明图1为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的引物筛选电泳图，其中，M为DL2000DNAmarks，1-9分别为阴性对照、PCV2-2-F/R与PCV3-4-F/R、PCV2-1-F/R与PCV3-4-F/R、PCV2-2-F/R与PCV3-3-F/R、PCV2-2-F/R与PCV3-5-F/R、PCV2-3-F/R与PCV3-4-F/R、PCV2-3-F/R与PCV3-5-F/R、PCV2-2-F/R与PCV3-1-F/R、PCV2-2-F/R与PCV3-2-F/R、PCV2-2-F/R与PCV3-6-F/R；图2为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的引物浓度优化电泳图，其中，M为DL2000DNAmarks，1为阴性对照，2-6为PCV2与PCV3引物的加入量，其加入体积分别为0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL；图3为为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的退火温度优化电泳图，其中，M为DL2000DNAmarks，1为阴性对照，2-9为不同退火温度，分别为60.1℃、59.3℃、58.0℃、56.0℃、53.5℃、51.6℃、50.3℃、49.6℃；图4为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的特异性试验的电泳图，其中泳道2为猪圆环病毒2型感染的电泳结果，泳道3为猪圆环病毒3型感染的电泳结果，泳道4为猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型混合感染的电泳结果，5、6、7、8、9分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪塞内加谷病毒、猪蓝耳病病毒、猪丁型冠状病毒的电泳结果，显示未检出；图5为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的敏感性试验的电泳图，其中泳道2-10分别为109拷贝/μL、108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL。具体实施方式以下所述是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪圆环病毒2型的检测引物，由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪圆环病毒3型的检测引物，由SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列的反向引物组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪圆环病毒2型的检测引物，由SEQIDNO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪圆环病毒3型的检测引物，由SEQIDNO：11所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：12所示的核苷酸序列的反向引物组成。2.如权利要求1所述的检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物在制备检测猪圆环病毒的制品中的应用。3.一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品制备基因组总DNA；2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。4.如权利要求3所述的用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR检测方法，其特征在于，双重PCR的反应体系总体积为50μl，包括：1)10μM的SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12所示核苷酸序列各1μl；2)10×ExPCRBμffer5.0μl；3)dNTPMixtμre4.0μl；4)ExTaqDNA聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺东生，俞丽，苏丹萍，徐帅飞，梁伟放，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44