一种检测BRCA1/2基因突变的引物池及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测BRCA1/2基因突变的引物组及方法。所述引物组包括三个引物池，共有97对引物，其上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～194所示。首先提取待测样本DNA，利用上述三个引物池进行多重PCR扩增，然后将三个引物池扩增所得目的片段合在一起，构建文库；最后文库测序并通过生物信息分析，获得样本BRCA1/2基因突变情况。该方法具有高通量、高准确性、高灵敏度、高自动化程度、样本需求量少、低成本、快速、可检测多种突变类型、可同时检测多位点突变等优点，可应用于肿瘤高风险筛查、用药指导以及预后等，在国内BRCA1/2基因突变检测及致病性分析评估方面具有重要的意义，具有广阔的应用前景。

Primer pool and detection method for detecting BRCA1/2 gene mutation

The invention discloses a primer group and a method for detecting the mutation of BRCA1/2 gene. The primer group consists of three primer pools, with 97 pairs of primers, and the upstream and downstream primer sequences are shown in sequence SEQ, ID, and NO.1 ~ 194. First, the sample DNA was extracted, and the three primer pools were used to amplify the multiple PCR. Then the three primer pools were amplified together to construct a library. Finally, the library was sequenced and analyzed by biological information to obtain the mutation of the BRCA1/2 gene. This method has the advantages of high throughput, high accuracy, high sensitivity, high automation, low sample demand, low cost, rapid detection, detection of multiple mutation types, and detection of multiple point mutations at the same time. It can be applied to high risk screening, medication guidance and prognosis of tumor, and it is detected and caused by BRCA1/2 gene mutation in China. Disease analysis and evaluation is of great significance and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种检测BRCA1/2基因突变的引物池及检测方法
本专利技术属于基因分析
更具体地，涉及一种基于半导体测序技术的BRCA1/2基因突变的检测引物池、检测方法及试剂盒。
技术介绍
BRCA1/2基因是一类肿瘤抑制基因，参与细胞同源重组修复(HRR)过程，能确保细胞的遗传物质(DNA)的稳定性，防止细胞变异。携带BRCA1或BRCA2的有害突变的人群罹患卵巢癌和乳腺癌的风险将显著增高，并且还存在一定的家族遗传性。同时，有害的BRCA1/2突变还可能增加患胰腺癌，胃癌，胆囊和胆管细胞癌，黑色素瘤、男性乳腺癌等其它风险。另外，研究发现BRCA1/2突变患者的5年生存率显著高于未突变者，对于铂类、脂质体阿霉素的敏感性也优于未突变者。BRCA1/2突变的患者(如卵巢癌、乳腺癌)给予PARPi，可显著抑制、杀死肿瘤细胞，延长患者的无进展生存。奥拉帕利是全球第一个针对BRCA1/2突变的PARPi，2014年，EMA批准奥拉帕利用于铂类敏感复发的BRCA突变卵巢癌，美国FDA批准了奥拉帕利可用于既往三线及以上铂类化疗的BRCA突变卵巢癌患者。因此卵巢癌患者的BRCA突变检测，能更好的评估患者预后、优化治疗方案、评价其亲属卵巢癌发病风险。BRCA1基因定位于人类染色体17q21，于1994年由Miki等克隆成功。BRCA1具有24个外显子，1号外显子不参与蛋白质的编码，4号外显子编码Alu重复序列，其中22个外显子编码一个具有1863个氨基酸的蛋白质，分子量为180000～220000D。BRCA2基因定位于人类染色体13q12-13，于1995年由Wooste克隆成功，它具有27个外显子，编码区长度为11.2kb，大约为BRCA1基因的2倍，编码一个具有3418个氨基酸的蛋白质。BRCA1/2基因发现已有20多年，针对不同人群的BRCA突变情况，已有较多报道，其中在卵巢癌家族史人群，BRCA胚系突变的发生率大致在12％～80％，而在散发的卵巢癌患者，BRCA胚系突变发生率为5％～29％，但研究数据的人群都是以高加索人种为主，仅有少量研究涉及到亚裔人群。此外，BRCA基因序列较大，整个BRCA基因的编码区突变都有可能造成BRCA基因的功能异常，而且目前的数据发现BRCA突变缺乏明确的突变热点，因此BRCA检测需要通过整个编码区的测序，通过比对目前大样本的数据库分析来确认，目前使用的数据库都是欧美人群的BRCA突变数据，缺乏中国人群特有的BRCA突变数据，因此中国人群的BRCA突变确认存在障碍。到目前为止，尚没有针对中国人群的BRCA突变率及突变特点的大样本研究。因此，针对中国人群的BRCA胚系突变情况的研究显得尤为迫切。目前常用的BRCA1/2突变检测方法有：变性高效液相色谱分析技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)、单链构象多态性检测(single-strandconformationpolymorphism，SSCP)、多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)、蛋白质截断测试(proteintruncationtest，PTT)、高分辨率溶解曲线(highresolutionmelting，HRM)、一代测序(Sangersequencing)以及高通量测序(NGS)等。DHPLC与HRM方法虽然检测准确性、敏感性以及特异性高，快速高效无毒，但是不能准确检测出具体突变类型。SSCP与PTT的优点在于快速且价格便宜，缺点是检测灵敏度低。MLPA法虽然高效、特异，但只能用于检测已知突变，比较适用于对已知“foundermutation”的人群进行筛查。一代测序虽然可以较为全面检测BRCA1/2突变，但其成本高，且不能检测大片段缺失重排，需联合MLPA使用。然而BRCA1/2基因较为庞大，突变分布于整个编码区，多为点突变或小的插入与缺失，且无热点突变，需要通过全基因扫描才能确定每个个体的突变情况。而高通量测序具有高通量、高准确性、高灵敏度、高自动化程度、低运行成本以及可检测多种突变类型等优点，因此在检测BRCA1/2突变中具有巨大的潜力和广阔的前景。目前欧美很多国家已经制定了适合BRCA1/2基因突变检测的人群标准。通过对这部分高危人群进行遗传咨询和遗传检测，可对突变携带者给予早期筛查与预防干预，对突变患者进行个体化治疗。但是，不同人群的外显率及突变频率均不相同，因此中国人群的BRCA1/2突变致病性确认仍存在障碍。然而在中国，目前尚未建立规范的遗传咨询机构，仅有的一些小规模或针对部分外显子的研究，BRCA1/2突变数据库数据根本不足以支持遗传风险评估。如果直接使用欧美人群的数据来解读中国人群的BRCA1/2突变是不准确的，且将可能会造成误诊。因此，建立中国人群的BRCA1/2突变数据库和标准品以规范BRCA1/2突变检测在临床的应用，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有中国人群的BRCA1/2基因突变检测及致病性分析评估技术的缺陷和不足，提供一种BRCA1/2基因突变的高通量检测方法，基因检测区域包括BRCA1/2外显子及可变剪切区域。具体是以多重PCR技术为基础结合高通量测序平台对BRCA1/2基因功能区突变进行检测的方法。该方法是采用灵敏度高、样本需求量少、可同时检测多位点突变的高通量测序技术，通过设计多重PCR引物并建库，建立的一种高准确性，高通量，低成本，快速的BRCA1/2基因突变检测方法。本专利技术的目的是提供一种检测BRCA1/2基因突变的引物组。本专利技术另一目的是提供一种BRCA1/2基因突变的检测方法。本专利技术的再一目的是提供一种检测BRCA1/2基因突变的试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种检测BRCA1/2基因突变的引物组，即BRCA1/2基因及其可变剪切区特异性扩增引物，包括三个引物池，引物池1包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.1～84所示；引物池2包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.85～168所示；引物池3包括13对引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.169～194所示。上述引物组在检测BRCA1/2基因突变方面的应用，在制备BRCA1/2基因突变检测试剂盒方面的应用，以及在构建包含BRCA1/2基因及可变剪切区的文库方面的应用，均应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还提供了一种BRCA1/2基因突变的检测方法，包括如下步骤：S1.分别用权利要求1所述三个引物池进行多重PCR扩增BRCA1/2外显子及可变剪切区；S2.将三个引物池扩增所得目的片段合在一起，并进行文库构建；S3.基于构建的文库，通过半导体测序法获取BRCA1/2基因信息，并通过生物信息分析，获得样本BRCA1/2基因突变情况。其中，所述的多重PCR是指：针对BRCA1/2外显子及可变剪切区的特异性扩增引物共97对，分成三个引物池，每个引物池包含的特异性引物见表1；以对样本提取获取的基因组DNA作为模板进行扩增。优选地，所述多重PCR扩增反应的循环数是18个循环。三个引物池是在设计了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测BRCA1/2基因突变的引物组，其特征在于，包括三个引物池，引物池1包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～84所示；引物池2包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.85～168所示；引物池3包括13对引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.169～194所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测BRCA1/2基因突变的引物组，其特征在于，包括三个引物池，引物池1包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.1～84所示；引物池2包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.85～168所示；引物池3包括13对引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.169～194所示。2.权利要求1所述引物组在检测BRCA1/2基因突变方面的应用。3.权利要求1所述引物组在制备BRCA1/2基因突变检测试剂盒方面的应用。4.权利要求1所述引物组在构建包含BRCA1/2基因及可变剪切区的文库方面的应用。5.一种BRCA1/2基因突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.分别用权利要求1所述三个引物池进行多重PCR扩增BRCA1/2外显子及可变剪切区；S2.将三个引物池扩增所得目的片段合在一起，并进行文库构建；S3.基于构建的文库，通过半导体测序法获取BRCA1/2基因信息，并通过生物信息分析，获得样本BRCA1/2基因突变情况。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）样本DNA提取：对静脉血进行DNA提取得到待测样本DNA；（2）目的片段扩增：以待测样本DNA为模板，分别利用权利要求1所述三个引物池进行多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；（3）消化引物序列：将步骤（2）中三个引物池扩增所得目的基因DNA片段合在一起，然后与引物消化液混合反应，得到去除已知扩增引物的平末端目的基因DNA片...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，吴英松，杨学习，朱安娜，梁志坤，许旭平，刘启祥，
申请(专利权)人：广州市达瑞生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44