用于淋巴细胞定量检测的标记物和淋巴细胞定量检测方法技术

本申请公开了一种用于淋巴细胞定量检测标记物和定量检测方法。本申请标记物，为DNA片段或含有DNA片段的质粒，DNA片段5’到3’端依序包括V区、M区和J区，V区由前导区基因和/或V基因全部或部分序列组成，J区由J基因全部或部分序列组成，M区包括外源核苷酸片段。本申请的标记物，在免疫组库建库时添加到gDNA中一起建库测序，定量标记物获得淋巴细胞数目。本申请的淋巴细胞定量方法，简单快速、明白直接；对生物实验要求和依赖度不高；可分析得致病克隆在PBMC/BMMC/有核细胞的比例，使基于高通量测序监控致病克隆比例成为现实，对免疫相关疾病早期诊断、预后监控、指导临床治疗有重要意义。

Quantitative markers for lymphocytes and quantitative detection of lymphocytes

The invention discloses a quantitative detection marker for lymphocytes and a quantitative detection method. The application marker is DNA fragment or plasmid containing DNA fragment. The DNA fragment 5 'to 3' end includes V, M and J regions. The V region is composed of all or partial sequences of the preamble and / or V genes. The J region is composed of all or part of the J gene, and the M region includes the exogenous nucleotide fragments. The markers of this application were added to the gDNA library during the establishment of the immune library. The lymphocytic quantitative method of this application is simple, quick and direct; the requirement and dependence of the biological experiment are not high; the proportion of the pathogenic clones in PBMC/BMMC/ nucleated cells can be analyzed, and the proportion of the pathogenic clone based on high throughput sequencing is the reality, the early diagnosis, the prognosis monitoring, and the clinical guidance of the immune related diseases, the clinical guidance, and the clinical guidance. Treatment is of great significance.

【技术实现步骤摘要】
用于淋巴细胞定量检测的标记物和淋巴细胞定量检测方法
本申请涉及淋巴细胞检测领域，特别是涉及一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，以及采用该标记物的淋巴细胞定量检测方法。
技术介绍
对免疫相关疾病而言，预后监控是尤为重要的。患者经过治疗后，微小残留往往会成为疾病复发的罪魁祸首。以白血病为例，经过治疗体内残留的白血病细胞通常低达109个以下。目前对于残留细胞的检测通常采用的是流式细胞仪，但是，流式细胞仪对于外周血中微量的残留细胞检测敏感性和特异性不好，会导致假阴性结果，不利于预后监控。因此，亟需一种可以对免疫相关疾病微小残留细胞进行检测和监控的技术，以便于预后监控或早期诊断。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，以及采用该标记物的淋巴细胞定量检测方法。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，标记物为DNA片段或者含有该DNA片段的质粒，该DNA片段从5’端到3’端依序包括V区、M区和J区，其中，V区由前导区基因和/或V基因全部或部分连续序列组成，J区由J基因的全部或部分连续序列组成，M区包括外源核苷酸片段。需要说明的是，“V区由前导区基因和/或V基因全部或部分连续序列组成”是指，V区为前导区基因的全部或部分连续序列，或者V区为V基因全部或部分连续序列，或者V区为前导区基因的全部或部分连续序列加上V基因全部或部分连续序列。其中，“前导区基因的全部或部分连续序列”是指，可以是前导区基因的全部基因序列，或者前导区基因中的任意一段序列，并且这段序列必须是前导区基因中的连续的序列。类似的，“V基因全部或部分连续序列”、“J基因的全部或部分连续序列”、“D基因的全部或部分连续序列”，也是指这些基因的全部序列，或者其中任意一段序列。还需要说明的是，本申请的标记物，其关键就在于，在其DNA片段的5’端和3’端分别具有V区和J区，这样在标记物添加到人基因组DNA中，进行免疫组库构建时，标记物的DNA片段就可以一起被PCR扩增和测序。但是，为了区分添加的标记物DNA片段和人基因组DNA片段，本申请的标记物DNA片段中，在V区和J区之间还具有M区。该M区可以是任意一段已知的外源核苷酸片段，例如其它和人基因组DNA没有同源性的微生物的片段，或者是一段随机序列，这样就可以和人基因组DNA的免疫组库区分开来。还需要说明的是，本申请的标记物，其分子拷贝数是已知的，使用时，将其添加到人基因组DNA样本中，一起进行免疫组库建库和测序，可以通过本申请的标记物定量出淋巴细胞的数量。可以理解，本申请的标记物是要添加到人基因组DNA样本中一起进行免疫组库建库和测序的，因此，标记物的DNA片段必须包含能够被人免疫组库建库引物识别和扩增的区域，即位于5’端的V区，和位于3’端的J区；与此同时，本申请的标记物DNA片段又必须与人基因组DNA的抗体序列区分开来，因此，还需要M区。优选的，M区中，外源核苷酸片段为barcode。优选的，在外源核苷酸片段为barcode时，M区还包括D基因的全部或部分连续序列。优选的，D基因的全部或部分连续序列的长度为0bp-100bp。需要说明的是，本申请中barcode是指识别序列，通常是一段随机序列，用于区分样本和标记物，长度通常在4-12bp。如前面提到的，本申请中M区可以是任意的外源核苷酸片段，只要能够将本申请的标记物DNA片段与人免疫组库DNA序列区分开来即可；在V区和J区够长的情况下，M区可以只是barcode。当然，M区也可以进一步的模拟人免疫组库的抗体序列，即M区为D基因的全部或部分连续序列，barcode可以在D基因全部或部分连续序列的前面或后面，或者直接插入D基因全部或部分连续序列之中。也就是说barcode的位置可以不做限定，只要是在V区和J区之间即可；甚至，在V区或者J区比较长的时候，在不影响标记物DNA片段跟人基因组DNA一起进行免疫组库构建的情况下，barcode还可以插入到V区或者J区；当然，前提是不影响标记物DNA片段跟人基因组DNA一起进行免疫组库构建，同时，barcode也必须被扩增和测序到，如果barcode插入V区或者J区，而不能被测序获得，就没有意义了。也就是说，M区实际上有三种情况，第一，M区为外源核苷酸片段；第二，M区为识别序列；第三，M区为识别序列加上D基因全部或部分连续序列。如前面提到的，M区的作用是将标记物DNA片段与人基因组DNA的抗体序列区分开来，因此，在M区为外源核苷酸片段时，其自然就具备区分人基因组DNA的抗体序列的功能，而M区为D基因的全部或部分连续序列时就需要额外添加识别序列，所以M区可以由D基因的全部或部分连续序列和识别序列组成，进一步的，M区也可以仅由识别序列，而不需要D基因，所以D基因的全部或部分连续序列的长度可以为0bp。优选的，V区的长度为10bp-400bp。优选的，J区的长度为10bp-100bp。优选的，DNA片段的总长度为100-500bp。需要说明的是，标记物DNA片段的总长度是根据所采用的测序平台的测序长度而调整的，选择测序平台最适合的测序长度，使得标记物DNA片段能够最有效的被扩增。本申请的另一面公开了本申请的标记物在淋巴细胞定量检测中的应用。本申请的再一面公开了本申请的标记物在免疫相关疾病的致病细胞检测，或者在制备免疫相关疾病早期诊断或预后监控检测试剂盒或设备中的应用。本申请的再一面公开了一种用于免疫相关疾病的致病细胞检测的试剂盒，其该试剂盒中含有本申请的标记物。需要说明的是，目前通过高通量测序技术已经可以准确的获得免疫相关疾病的致病克隆在T/B淋巴细胞中的准确比例，而临床上通常是根据致病克隆在PBMC/BMMC/有核细胞中的比例来分析判断的。本申请的淋巴细胞定量检测方法，可以获得淋巴细胞数目，即可以定量出T/B淋巴细胞在PBMC/BMMC/有核细胞中的比例，从而将致病克隆在T/B淋巴细胞中的比例，转换成致病克隆在PBMC/BMMC/有核细胞中的比例，与临床标准接轨。因此，本申请的标记物完全可以用于免疫相关疾病的致病细胞检测，或者用于制备免疫相关疾病早期诊断或预后监控检测试剂盒或设备。本申请的再一面公开了一种淋巴细胞定量检测的方法，包括在免疫组库测序的过程中，将已知分子拷贝数的本申请的标记物人为掺入人基因组DNA样本中，然后对混合样本进行免疫组库建库，上机测序获得淋巴细胞的reads数，和标记物中DNA片段的reads数，即标记序列的reads数，根据公式，(标记序列的reads数)/(标记序列的分子数)＝(淋巴细胞的reads数)/(淋巴细胞的分子数)，获得淋巴细胞的分子数，即淋巴细胞的数量。需要说明的是，本申请的关键在于，在人基因组DNA样本中掺入已知分子拷贝数的标记物，对淋巴细胞的分子数进行标记定量，通过(标记序列的reads数)/(标记序列的分子数)＝(淋巴细胞的reads数)/(淋巴细胞的分子数)的等比关系，计算出淋巴细胞的数量。至于，免疫组库建库可以参考现有的高通量免疫组库测序；而上机测序、标记序列的reads数和淋巴细胞的reads数的分析获得等，都可以在现有的高通量测序平台进行，在此不做具体限定。优选的，淋巴细胞为B淋巴细胞或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，其特征在于：所述标记物为DNA片段或者含有所述DNA片段的质粒，所述DNA片段从5’端到3’端依序包括V区、M区和J区，所述V区由前导区基因和/或V基因全部或部分连续序列组成，所述J区由J基因的全部或部分连续序列组成，所述M区包括外源核苷酸片段。

【技术特征摘要】
1.一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，其特征在于：所述标记物为DNA片段或者含有所述DNA片段的质粒，所述DNA片段从5’端到3’端依序包括V区、M区和J区，所述V区由前导区基因和/或V基因全部或部分连续序列组成，所述J区由J基因的全部或部分连续序列组成，所述M区包括外源核苷酸片段。2.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于：所述M区中，外源核苷酸片段为barcode；优选的，所述M区还包括D基因的全部或部分连续序列；优选的，所述D基因的全部或部分连续序列的长度为0bp-100bp。3.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于：所述V区的长度为10bp-400bp。4.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于：所述J区的长度为10bp-100bp。5.根据权利要求1-4任一项所述的标记物，其特征在于：所述DNA片段的总长度为100-500bp。6.根据权利要求1-5任一项所述的标记物在淋巴细胞定量检测中的应用。7.根据权利要求1-5任一项所述的标记物...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新洋，武靖华，刘晓，王长希，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44