The present invention provides a method of rapid optimization of metal ions by the response surface method to promote sporulation of Bacillus spore, including the following steps: using the DPA fluorescence intensity of the spore as the response value, the single factor test design is first used to screen the metal ions which may affect the spore fermentation and select the fluorescence intensity when the ion concentration is changed. The types of metal ions and their optimum concentration were significantly increased. The combination of DPA fluorescence intensity was used as the response value, and the combination effect of metal ions was determined by the statistical analysis of the response surface, so as to maximize the spore yield under a certain concentration of ion concentration. The method provided by the invention can greatly reduce the work strength of the test design test during the spore fermentation process, shorten the test period, ensure the accuracy of the test and improve the design efficiency.
【技术实现步骤摘要】
一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法
本专利技术具体涉及一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法,属于微生物发酵工程
技术介绍
芽孢杆菌是一类耗氧或者兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,因其产生抗逆性的芽孢而使其成为一类特别的微生物类群。因其稳定性很强,并且能够在人和动物胃肠道存活并萌发代谢,作为活的微生物添加剂现已广泛用于人类医药、动物饲料中,对于保障机体健康,调节肠道微生物平衡,增加免疫力等方面具有积极作用。与其他非芽孢微生物不同,芽孢杆菌的芽孢是营养细胞生长到后期产生的一个休眠体,因其生长环境中营养缺乏、细胞累积等因素而大量产生。同时也会受到培养基或者发酵条件中的金属离子浓度、碳氮源的组成、氧的供给等因素影响。作为一种微生物活菌制剂,在工业化生产时,既需要控制条件使得其发酵环境中芽孢最大限度的积累,又需要尽可能降低生产成本,从而实现工业生产和应用利润的最大化。已有研究表明,一些金属离子对于某些芽孢杆菌芽孢的形成具有显著影响,在芽孢发酵培养基中添加合适的金属离子可以有效提高芽孢含量。因此,通过优化选择金属离子类型及其添加浓度为芽孢的发酵产量提高提供了一种可靠途径。现在很多的生物发酵研究都是采用的统计软件精心构建高效实验设计来进行微生物发酵的优化,这种优化方法在较少的试验次数的基础上采用数学模拟和优化,大大简化了试验步骤,还提高了准确性。但对于芽孢的发酵而言,通常也都是采用平板计数的传统方法来测定芽孢浓度作为试验设计的响应值。以一次4因素的响应面设计为例,如果中心点采用三次重复,往往最少需要27次试验,为了确保实验设计的可 ...
【技术保护点】
一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)单因子试验设计:在基础培养基的基础上,分别选取不同的可能对芽孢生成起到促进作用的金属离子,分别改变其在发酵液中的最终摩尔浓度,经过36h‑60h发酵培养后,用移液器取其芽孢悬液1毫升,洗涤该芽孢悬液,用于芽孢DPA荧光强度的检测;(2)芽孢悬液的处理及荧光检测:芽孢悬液采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢清液经过一定程度稀释后测定其荧光强度;将上清液稀释后与EuCl3和环己二胺四乙酸充分混合均匀,采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度,测定过程中激发波长范围260~280nm,发射波长范围610~630nm;(3)显著性因子的筛选:以芽孢DPA荧光强度为响应值,对单因子试验设计中能影响到芽孢发酵的金属离子进行筛选,选取离子浓度改变时对荧光强度产生显著增强的金属离子类型及其最适的添加浓度;(4)采用中心组合设计,确定金属离子的组合效应,实现在一定的离子浓度组合情况下芽孢产量的最大化:根据单因子试验设计的实验结果,以显著正效应的金属离子及其最大荧光强度效应时的浓度作为响应面优化实验因素的中心点, ...
【技术特征摘要】
1.一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)单因子试验设计:在基础培养基的基础上,分别选取不同的可能对芽孢生成起到促进作用的金属离子,分别改变其在发酵液中的最终摩尔浓度,经过36h-60h发酵培养后,用移液器取其芽孢悬液1毫升,洗涤该芽孢悬液,用于芽孢DPA荧光强度的检测;(2)芽孢悬液的处理及荧光检测:芽孢悬液采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢清液经过一定程度稀释后测定其荧光强度;将上清液稀释后与EuCl3和环己二胺四乙酸充分混合均匀,采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度,测定过程中激发波长范围260~280nm,发射波长范围610~630nm;(3)显著性因子的筛选:以芽孢DPA荧光强度为响应值,对单因子试验设计中能影响到芽孢发酵的金属离子进行筛选,选取离子浓度改变时对荧光强度产生显著增强的金属离子类型及其最适的添加浓度;(4)采用中心组合设计,确定金属离子的组合效应,实现在一定的离子浓度组合情况下芽孢产量的最大化:根据单因子试验设计的实验结果,以显著正效应的金属离子及其最大荧光强度效应时的浓度作为响应面优化实验因素的中心点,采用统计软件Box-Benhnken设计或者中心组合设计进行实验设计,以芽孢释放产生的DPA荧光强度作为响应值,对响应面模型进行方差分析,确定离子组合效应及对芽孢发酵产生的DPA荧光强度最大值。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述芽孢杆菌为淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensBS-20,所述解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensBS-20已于2017年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC:M2017587,分类命名为解淀粉芽孢杆菌BS-20(B...
【专利技术属性】
技术研发人员:郭小华,任航,苏雅婷,
申请(专利权)人:中南民族大学,
类型:发明
国别省市:湖北,42
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