一种维生素C二步发酵生产方法技术

本发明专利技术涉及一种维生素C二步发酵生产方法，该方法包括对由巨大芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的混合菌系的三级种子培养，特点是将培养好的三级种子液直接接入到灭菌处理过的发酵培养基中进行发酵培养，同时在发酵一开始就流加L‑山梨糖，发酵培养基以尿素、生物素、玉米浆、磷酸二氢钾和硫酸镁配比。本发明专利技术通过优化发酵培养基组成、删减了灭菌后发酵培养基中的合糖操作、移种后即时流加山梨糖的补料策略，从而改善了混菌生长代谢环境，最终提高了产酸速率、提高了古龙酸产量、提高发了酵转化率，降低发酵结束时的物质残留，改善发酵液质量，并缩短了发酵周期。

A two step fermentation method for vitamin C production

The invention relates to a method for producing vitamin C two step fermentation, which includes three stage seed culture of a mixed strain of Bacillus gigantobacilli and ketogenic cologenic bacteria. The characteristic is that the cultured three seed liquid is directly connected to the fermentation medium with sterilized fermentation, and the fermentation is at the same time. L sorbitol was added to the fermentation medium, and the fermentation medium was composed of urea, biotin, corn steep liquor, potassium dihydrogen phosphate and Magnesium Sulfate. By optimizing the fermentation medium and reducing the sugar operation in the sterilization culture medium after sterilization and the feeding strategy of instant flow and sorbis after being moved, the growth and metabolism environment of the mixed bacteria is improved, the rate of acid production, the yield of cologonic acid, the conversion rate of fermented fermentation, and the end of fermentation are improved. Material residues can improve the quality of fermentation broth and shorten the fermentation period.

【技术实现步骤摘要】
一种维生素C二步发酵生产方法
本专利技术涉及生物与新医药技术，特别是涉及一种维生素C二步发酵生产方法。
技术介绍
维生素C又名L—抗坏血酸，是一种水溶性维生素，具有重要的生理功能，用途十分广泛。当前，我国维生素C产量巨大，占世界总产量的90%以上，其中产量80%以上出口。生产方法国内以“二步发酵法”为主，第一步是在黑醋酸杆菌作用下，将D-山梨醇氧化成L-山梨糖，俗称醇糖转化；此步发酵工艺成熟且转化率高，现已能达98%以上；目前国内外对其相关基因和转化基质的研究已经比较清楚；第二步是由巨大芽孢杆菌(俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)组成的混合菌系的作用下将L～山梨糖进一步氧化成2-酮基-L-古龙酸，俗称糖酸转化。混合发酵时伴生菌先行生长，代谢释放出具有生物活性的蛋白，随之作用于产酸菌，启动其生长、产酸。即产酸菌的生长和产酸能力很大程度上受伴生菌生长代谢的制约，因此通过改进配方、优化大菌生长环境、调节大菌生理状态，促进混菌代谢，对于提高2-酮基-L-古龙酸发酵指数、提高产能、降低生产成本具有决定性的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种维生素C二步发酵方法，该方法通过改善发酵培养基配方，优化发酵工艺，从而有效提高了产酸速率，提高了古龙酸产量，提高发酵转化率，并且可有效降低发酵结束时的物质残留，改善发酵液质量。为实现上述专利技术目的所采取的技术方案为：一种维生素C二步发酵生产方法，包括对由巨大芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的混合菌系的三级种子扩大培养，其特征是，将培养好的三级种子液直接接入到灭菌处理过的发酵培养基中进行发酵培养，同时在发酵一开始就流加L-山梨糖，其中所述发酵培养基组成为：尿素0.1～0.3%、生物素0.01～0.04%、玉米浆1.5～2.5%、磷酸二氢钾0.1～0.3%、硫酸镁0.01～0.04%。所述发酵培养条件为：接种量15～30%，培养温度28～30℃；通气量1：0.5～1.2v/v/min，搅拌、补料；发酵过程溶氧保证在20%以上，培养周期40～45hr放罐。所述L-山梨糖的流加量以控制发酵液中残糖15～35mg/ml为基准，放罐前4～8h结束流加L-山梨糖，放罐残糖低于0.6mg/ml。在发酵过程中还需要补碱液，所述碱液为质量浓度为25%无菌碳酸钠溶液，控制发酵液中pH7.0～7.5。所述三级种子扩大培养中一级种子培养基组成：L-山梨糖1.2～1.5%、葡萄糖0.2～0.5%、硫酸镁0.08～0.12%、尿素0.1～0.2%、玉米浆1.0～1.2%、碳酸钙0.05～0.1%；pH7.0～7.4；一级种子培养过程控制：培养温度：28～30℃，通气量1：1.0～1.5v/v/min并搅拌，培养周期：24±4h；二级种子培养基组成：L-山梨糖1.2～1.5%、葡萄糖0.2～0.5%、硫酸镁0.08～0.12%、尿素0.1～0.2%、玉米浆1.0～1.2%、碳酸钙0.05～0.1%；pH7.0～7.4；二级种子培养过程控制：接种量：3～5%；培养温度：28～30℃；通气量1：1.0～1.5v/v/min并搅拌，培养周期：20～28hr；三级种子培养基组成：L-山梨糖1.2～1.5%、葡萄糖0.2～0.5%、硫酸镁0.01～0.04%、尿素0.1～0.2%、玉米浆1.0～1.5%、碳酸钙0.08～0.20%；pH7.0～7.4；三级种子培养过程控制：接种量：8～10%；培养温度：28～30℃；通气量1：1.0～1.5v/v/min并搅拌，培养周期：16～24h。采用上述方法，最终放罐周期：40～45h；放罐酸含量143.3～152.4mg/ml；残糖≤0.6mg/ml；滤液透光度：90.7～92.3%；发酵指数：3.47～3.73g/L.h；平均产酸速率3.342～3.676mg/ml.h。本专利技术的技术效果主要体现在以下几个方面：1、本专利技术优化了发酵培养基配方，在培养基中增加了生物素，减少了玉米浆的使用。玉米浆是发酵培养基的成分之一，以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得。外观色呈深褐色，固含物或均匀细腻或粗略不匀；玉米浆因其富含可溶性蛋白和多种游离氨基酸而在VC二步发酵生产中属于主要氮源，但其固含物量的多少、固含物的粗细度均会影响发酵生产的稳定，并且会加深发酵醪液的色泽，对下游工序的提取、结晶造成影响。故而添加生物素并减少玉米浆的用量来优化发酵培养环境，能更好的促进产酸菌与伴生菌之间的协调并使其达到最佳状态，提高产酸速率、提高古龙酸产量、提高发酵转化率转化率，降低发酵结束时的物质残留，改善发酵液质量。通过上述改变，发酵液外观色泽良好，放罐滤液透光度提高5%以上。2、本专利技术是删减了灭菌后发酵培养基中的合糖操作，降低了移后培养液中山梨糖的浓度、降低了菌体生长环境的渗透压；采用移种后即时流加山梨糖的补料策略，解除了高浓度底物对菌体生长的阻遏效应，改善了混菌生长代谢环境，使发酵周期缩短5～10h。3、通过生物素的添加结合配方及补料工艺的优化，有效改善了混菌生长的环境、提高了菌体质量，促进了小菌的生长、增殖、代谢及产酸；古龙酸平均产酸速率提高10%以上；发酵指数提高10%以上。具体实施方式下面用实例予以说明本专利技术，应该理解的是，实例是用于说明本专利技术而不是对本专利技术的限制。本专利技术的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。下述对比实施例和实施例中，发酵菌种为巨大芽孢杆菌(俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)组成的混合菌系。对比实施例1菌种活化：将按常规方法取菌种一支，按一定接种量接入摇瓶种子培养基中，180～220rpm、29±1℃恒温振荡培养20±4h，至古龙酸含量≥5mg/ml，按此活化三代后得到三代种液，将三代种液按2～10%的接种量接种于灭菌好的种子培养基中。2三级种子扩大培养：2.1一级种子：一级种子培养基（%）：L-山梨糖1.2、葡萄糖0.25、硫酸镁0.09、尿素0.13、玉米浆1.0、碳酸钙0.08；pH7.0～7.4、118～121℃灭菌15～20min。过程控制：将巨大芽孢杆菌(俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)组成的混合菌系接入上述一级培养基中，将制备好的菌种接入上述一级培养基中，接种量：5%，培养温度：28～30℃；通气量1：1.0～1.5v/v/min并搅拌，培养周期：24±2hr。2.2二级种子：二级种子培养基（%）：L-山梨糖1.2、葡萄糖0.25、硫酸镁0.09、尿素0.13、玉米浆1.0、碳酸钙0.08；pH7.0～7.4、118～121℃灭菌15～20min。过程控制：将上述2.1所得一级种子液接入二级种子培养基中，接种量：5%；培养温度：28～30℃，通气量1：1.0～1.5v/v/min并搅拌，培养周期：24±2hr。2.3三级种子：三级种子培养基（%）：L～山梨糖1.5、葡萄糖0.25、硫酸镁0.09、尿素0.14、玉米浆1.1、碳酸钙0.08；pH7.0～7.4、118～121℃灭菌15～20min。过程控制：将上述2.2所得二级种子液接入三级种子培养基中，接种量：10%；培养温度：28～30℃；通气量1：1.0～1.5v/v/min并搅拌，培养周期：20±4hr。3发酵：3.1发酵培养基（%）：L-山梨糖：8.0、尿素0.14、玉米浆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种维生素C二步发酵生产方法，包括对由巨大芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的混合菌系的三级种子扩大培养，其特征是，将培养好的三级种子液直接接入到灭菌处理过的发酵培养基中进行发酵培养，同时在发酵一开始就流加L～山梨糖，其中所述发酵培养基组成为：尿素0.1～0.3%、生物素0.01～0.04%、玉米浆1.5～2.5%、磷酸二氢钾0.1～0.3%、硫酸镁0.01～0.04%。

【技术特征摘要】
1.一种维生素C二步发酵生产方法，包括对由巨大芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的混合菌系的三级种子扩大培养，其特征是，将培养好的三级种子液直接接入到灭菌处理过的发酵培养基中进行发酵培养，同时在发酵一开始就流加L～山梨糖，其中所述发酵培养基组成为：尿素0.1～0.3%、生物素0.01～0.04%、玉米浆1.5～2.5%、磷酸二氢钾0.1～0.3%、硫酸镁0.01～0.04%。2.按照权利要求1所述的维生素C二步发酵生产方法，其特征在于所述发酵培养条件为：接种量15～30%，培养温度28～30℃；通气量1：0.5～1.2v/v/min，搅拌、补料；发酵过程溶氧保证在20%以上，培养周期40～45hr放罐。3.按照权利要求1所述的维生素C二步发酵生产方法，其特征在于所述L-山梨糖的流加量以控制发酵液中残糖15～35mg/ml为基准，放罐前4～8h结束流加L-山梨糖，放罐残糖低于0.6mg/ml。4.按照权利要求1所述的维生素C二步发酵生产方法，其特征在于，在发酵过程中还需要补碱液，所述碱液为质量浓度为25%无菌碳酸钠溶液，控制发酵液中pH7.0～7.5。5.按照权利要求1所述的维生素C二步发酵生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔莉，盛雪，孙瑞君，郝旺，
申请(专利权)人：宁夏启元药业有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64