一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法。构建得到一种基因工程酵母质粒载体，该质粒载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，其中一个启动子GAL10能够将外源蛋白定位至酵母表面；另外一个启动子GAL1控制的基因的蛋白表达于酵母的细胞质内。本发明专利技术的工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内，酵母表面的蛋白可以用于蛋白功能研究，胞内荧光强度指示酵母数量而达到的高效、简便、经济的目的以及用于胞内蛋白研究。

Construction method of engineering yeast with dual channel protein expression

The invention belongs to the field of gene engineering technology, in particular to a construction method of engineering yeast with double channel protein expression. A plasmid vector for gene engineering yeast was constructed, which carried two promoters GAL10 and GAL1 expressing foreign genes. One promoter GAL10 could locate the exogenous protein to the yeast surface, and the protein of another promoter GAL1 controlled gene was expressed in the cytoplasm of the yeast. The engineered yeast is capable of transporting two different proteins through different protein expression channels to the yeast surface or located in the cytoplasm. The protein on the yeast surface can be used for protein function research. The intracellular fluorescence intensity indicates the efficient, simple, economical purpose of the yeast number and the intracellular protein. Research\u3002

【技术实现步骤摘要】
一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法
本专利技术属于基因工程
，涉及一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，本专利技术构建得到一种酵母质粒载体，该载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，其中启动子GAL10表达的基因与酵母凝集素小亚基融合，由于凝集素小亚基将与定位在酵母表面的凝集素大亚基共价结合，因此将携带外源蛋白一起定位至酵母表面；另外一个启动子GAL1控制的基因，其蛋白表达于酵母的细胞质内。本专利技术的工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内。
技术介绍
酵母表面展示(简称YSD)是将外源蛋白表达于酵母体内并通过酵母表面凝集素将其携带至细胞表面的一种技术(Boder,etal.,1997.)。a型凝集素大亚基Aga1共价连接于酵母表面β-葡聚糖，而小亚基Aga2又与Aga1之间形成两对二硫键。据此，Boder和Wittup等将Aga1蛋白整合到酵母基因组，并用一个质粒载体以Gal1启动子表达Aga2和外源基因的融合蛋白。因此外源基因便以融合蛋白的形式随Aga2转移到酵母表面。由于融合蛋白被共价地展示于细胞表面，可以方便地用外源蛋白的受体或抗体，或置于外源蛋白前或者后的寡肽的通用抗体来检测蛋白的表达，借助常用的流式细胞仪，可快速定量检测外源蛋白与受体间的亲和力。YSD的这些特点，使其能够非常适用于文库筛选，增强蛋白稳定性和表达量，以及定位蛋白功能结构域等。YSD尤其对于无需构建大容量文库的蛋白定向进化非常有效，如利用该技术使蛋白亲和力提高了二十万倍(Jin,M.etal.,2006)。酵母表面双杂交系统(YS2H)，是通过分泌途径来分析蛋白互作的一个平台，这种系统是在酵母表面展示系统的基础上发展起来的，优点在于无需蛋白表达纯化，在酵母体内同时表达这两个蛋白并最终展示于酵母表面。在YSD基础上酵母表面展示一个外源蛋白X，另一个蛋白Y则以分泌的形式表达，如果X能结合Y，那么Y则可以与X一起附于酵母表面，利用Y或与Y融合的寡肽的抗体来检测他们的亲和性，并且X和Y之间的亲和性可以通过流式细胞仪定量(Hu,.etal.,2009)。这种技术有几个特点：①将Gall和Gall0启动子的联用。②建立利用酵母蛋白分泌途径的蛋白-蛋白相互作用体系。③本系统无需蛋白纯化即可进行蛋白的定向进化以及文库受体筛选。炎症相关的蛋白——淋巴功能相关抗原-1蛋白(LFA-1)和细胞间黏连蛋白分子1(ICAM-1)在机体炎症信号中扮演重要角色。在没有炎症时，LFA-1结构为野生型(Wt)，ICAM-1不与其结合。但当炎症发生时，LFA-1的蛋白结构发生构象变化，成为高亲和性结构(HA)，此时与ICAM-1能紧密结合，传导炎症信号(Luo，1997)。LFA-1包含两个结构复杂的α和β亚基蛋白；其中α亚基的插入结构域(Idomain)负责与ICAM-1结合，且自身也存在构象变化，即与ICAM-1结合前后从Wt到HA状态。为了方便研究，科学家通过各种途径找到了LFA-1插入结构域的高亲和性(HA)突变体(Jin，2006；Hu，2010)。小鼠是常用试验动物，小鼠LFA-1与人源蛋白之间高度相似，但是彼此间不能简单互换。因此申请人利用已经发表的方法(HuX,KangS,LefortC,etal.Combinatoriallibrariesagainstlibrariesforselectingneoepitopeactivation-specificantibodies[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,107(14):6252-6257；HuX,KangS,ChenX,etal.Yeastsurfacetwo-hybridforquantitativeinvivodetectionofprotein-proteininteractionsviathesecretorypathway[J].JournalofBiologicalChemistry,2009,284(24):16369-16376.)，在YSD基础上设计了酵母表面双杂交(YS2H)系统，是无需蛋白表达纯化的新型蛋白互作系统，使酵母同时表达两个蛋白并最终展示于酵母表面。酵母表面展示一个外源蛋白(X)，另一蛋白(Y)则以分泌形式表达，如果X与Y结合，那么Y则与X一起运输至酵母表面，利用Y或者与Y融合的寡肽的抗体检测其亲和性，进行文库受体筛选得到一种小鼠LFA-1蛋白αL亚基Idomain的高亲和性突变体(F292S/T208I、F292S/F277L/F267G)以及相对于野生型(Wt)更不亲合的突变体(F292S/F277L)。同时我们在酵母表面双杂交(YS2H)系统基础上进行改进，把YS2H载体的启动子GAL1后面的分泌信号肽去掉，使其蛋白表达于酵母的细胞质内。本专利技术可应用于生物学、医学、药学、农学、畜牧兽医学、水产学、食品科学等与分子生物学相关的蛋白质功能分析和研究领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，构建一种酵母质粒载体，该载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，启动子GAL10将外源蛋白定位在酵母表面，GAL1将外源蛋白定位在酵母细胞内。本专利技术中工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内，可以应用于蛋白质功能分析和研究。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术方案一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，包括以下步骤：(1)双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体的构建：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α-半乳糖苷酶Aga2基因、小鼠LFA-1αLIdomain胞外域和Flag标签，使小鼠LFA-1αLIdomain胞外域、Flag标签和的α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，能够展示于酵母细胞EBY100的表面；在启动子GAL1的后面依次连接GFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达GFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαLId-wGFP；因小鼠LFA-1αLIdomain胞外域基因片段有四个，分别为wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G，所以得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαLId-wGFP有四个，分别为pDV3-intre-muαLIdwt-wGFP、pDV3-intre-muαLIdF292S/T208I-wGFP、pDV3-intre-muαLIdF292S/F277L-wGFP、pDV3-intre-muαLIdF292S/F277L/F267G-wGFP。所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；所述的α-半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；小鼠LFA-1αLIdomain胞外域为四个，wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体的构建：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α‑半乳糖苷酶Aga2基因、小鼠LFA‑1αL I domain胞外域和Flag标签，使小鼠LFA‑1αL I domain胞外域、Flag标签和的α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，能够展示于酵母细胞EBY100的表面；在启动子GAL1的后面依次连接GFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达GFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑muαL I d‑wGFP；分离小鼠LFA‑1αL I domain胞外域基因片段四个，分别为wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G，得到四个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑muαL Id‑wGFP，分别为pDV3‑intre‑muαL Idwt‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/T208I‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/F277L‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/F277L/F267G–wGFP；所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述的α‑半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；小鼠LFA‑1αL I domain胞外域为四个，所述的wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述的Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；所述的启动子GAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，GFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑muαL I d‑wGFP为四个，分别为pDV3‑intre‑muαL Idwt‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/T208I‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/F277L‑wGFP、pDV3‑intre‑muαL Id F292S/F277L/F267G–wGFP，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示；(2)双通道蛋白表达工程酵母载体的验证：将步骤(1)所述的质粒载体pDV3‑intre‑muαL I d‑wGFP以PEG/LiAc方法转入酵母细胞EBY100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达，得到表面展示有目标蛋白的酵母细胞后，通过流式细胞仪检测小鼠LFA‑1αL I domain和GFP荧光蛋白是否表达。...

【技术特征摘要】
1.一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体的构建：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α-半乳糖苷酶Aga2基因、小鼠LFA-1αLIdomain胞外域和Flag标签，使小鼠LFA-1αLIdomain胞外域、Flag标签和的α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，能够展示于酵母细胞EBY100的表面；在启动子GAL1的后面依次连接GFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达GFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαLId-wGFP；分离小鼠LFA-1αLIdomain胞外域基因片段四个，分别为wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G，得到四个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαLId-wGFP，分别为pDV3-intre-muαLIdwt-wGFP、pDV3-intre-muαLIdF292S/T208I-wGFP、pDV3-intre-muαLIdF292S/F277L-wGFP、pDV3-intre-muαLIdF292S/F277L/F267G–wGFP；所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；所述的α-半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQIDNO：9...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡学博，张启云，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42