抗HIV-1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制备方法技术

本发明专利技术公开了抗HIV‑1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制备方法，所述基因由GM‑CSF核酸人工序列与gp120‑CD4模块串联组成，所述gp120‑CD4模块含有以下基因片段中的至少一条；(1)gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(2)gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(3)gp120(AE)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列。本发明专利技术为将gp120与CD4类似物或CD4“迷你蛋白”连接在一起，使其构象发生改变并在CD4结合位点上暴露出抗原表位，使抗体识别并与暴露出的抗原相结合，从而刺激机体产生细胞免疫和体液免疫反应。

Anti HIV-1 gene, application of the gene, DC vaccine with the gene and vaccine preparation method

The invention discloses the anti HIV 1 gene, the application of the gene, the DC vaccine and the preparation method of the gene. The gene is made up of the GM CSF nucleic acid artificial sequence and the gp120 CD4 module, and the gp120 CD4 module contains at least one of the following gene fragments; (1) the gp120 (B) nucleic acid artificial sequence and the G4S nucleic acid artificial sequence. Sequence and CD4 nucleic acid artificial sequence; (2) gp120 (C) nucleic acid artificial sequence, G4S nucleic acid artificial sequence, CD4 nucleic acid artificial sequence; (3) gp120 (AE) nucleic acid artificial sequence, G4S nucleic acid artificial sequence, CD4 nucleic acid artificial sequence. The present invention is to connect gp120 with CD4 analogues or CD4 \mini protein\ to make the conformation change and expose the antigen epitopes on the CD4 binding site, so that the antibodies are identified and combined with the exposed antigens to stimulate the body to produce cellular and humoral immune responses.

【技术实现步骤摘要】
抗HIV-1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制备方法
本专利技术涉及基因
，尤其涉及抗HIV-1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制备方法。
技术介绍
艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)是由Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus1，HIV-1)感染引起的一种死亡率极高的慢性传染病，已成为威胁人类最严重的病毒病之一。据世界卫生组织的估计，目前全球约有4000万人受艾滋病病毒感染，其中200万为儿童，死亡人数达到3500万。目前已有40多种HIV疫苗用于预防或治疗艾滋病，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗，但由于HIV-1(HIV)变异快、亚型多、攻击自身免疫系统等特点，HIV疫苗虽已进入临床试验但是均未达到预期的效果，从而限制了其应用。因此，迫切需要研发一种安全、有效、具有良好免疫保护作用的HIV疫苗。目前，发现艾滋病、结核及乙型肝炎等一些慢性疾病在持续性、周期性感染中，应用其治疗性疫苗后，可控制感染并增强机体的天然免疫力，成为当前病毒研究的热点。利用包膜蛋白(ENV)诱发有效的中和抗体，一直是HIV疫苗研发的重要策略。专利申请号为201010126144.3的中国专利，公开了密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗。本专利技术应用多序列比对分析，获得中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列；应用人工合成的方法制备编码共有氨基酸序列的gp120基因片段，该基因经密码子优化，兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好；在此基础上，构建了由gp120基因和真核表达载体pJW4303组成的HIV-1gp120核酸疫苗。该核酸疫苗可以应用于动物和人体免疫，也可以应用于gp120蛋白的表达和生产。但是，在试验中发现，抗原表位比较难暴露，导致结合位点亲和力较弱，病毒突变免疫逃逸的可能性大大增加。因此，开发一种新抗HIV-1基因，并利用其制备成疫苗，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和医用潜力，这正是本专利技术得以完成的动力所在和基础。
技术实现思路
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本专利技术人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本专利技术。具体而言，本专利技术所要解决的技术问题是：提供抗HIV-1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制备方法，以提高结合度。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：第一方面，本专利技术提供了抗HIV-1基因，该基因由GM-CSF核酸人工序列与gp120-CD4模块串联组成，所述gp120-CD4模块含有以下基因片段中的至少一条；(1)gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(2)gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(3)gp120(AE)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；当所述gp120-CD4模块含有两条或以上的基因片段时，含有的所述基因片段串联。更详细的说，本专利技术的抗HIV-1基因可以为如下基因序列：GM-CSF-(1)、GM-CSF-(2)、GM-CSF-(3)、GM-CSF-(1)-(2)、GM-CSF-(1)-(3)、GM-CSF-(2)-(3)、GM-CSF-(1)-(2)-(3)；也可以是GM-CSF-(2)-(1)、GM-CSF-(3)-(1)、GM-CSF-(3)-(2)、GM-CSF-(2)-(1)-(3)、GM-CSF-(2)-(3)-(1)、GM-CSF-(3)-(1)-(2)、GM-CSF-(3)-(2)-(1)、GM-CSF-(1)-(3)-(2)。本专利技术中，作为一种优选的技术方案，所述抗HIV-1基因为以下基因序列顺序串联：GM-CSF核酸人工序列，如SEQIDNO.1；gp120(B)核酸人工序列，如SEQIDNO.2；G4S核酸人工序列，如SEQIDNO.5；CD4核酸人工序列，如SEQIDNO.6；gp120(C)核酸人工序列，如SEQIDNO.3；G4S核酸人工序列，如SEQIDNO.5；CD4核酸人工序列，如SEQIDNO.6；gp120(AE)核酸人工序列，如SEQIDNO.4；G4S核酸人工序列，如SEQIDNO.5；CD4核酸人工序列，如SEQIDNO.6。本专利技术中，将上述的基因定义为GM-CSF-gp120(B)-CD4-gp120(C)-CD4-gp120(AE)-CD4(或HIV-gp120-CD4)。第二方面，本专利技术提供了该基因的应用。该基因在制备抑制HIV病毒药物方面的应用。尤其是在抑制HIV-1的B、C、CRF01_AE三种亚型中国流行株病毒药物方面的应用。在应用时，可以将该基因制成DC疫苗。第三方面，本专利技术提供了具有该基因的DC疫苗。所述DC疫苗是指具有所述抗HIV-1基因的DC细胞。第四方面，本专利技术提供了疫苗制备方法，包括如下步骤：(1)人工合成所述抗HIV-1基因的整个表达框，插入到慢病毒表达载体plent-C-GFP，纯化后获得重组表达载体的高品质质粒；(2)将步骤(1)得到的质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，培养后得到g120-CD4病毒液；(3)利用步骤(2)得到的g120-CD4病毒液感染未成熟的DC细胞，并培养未成熟的DC细胞至成熟，即得到表达gp120-CD4的DC疫苗。采用了上述技术方案后，本专利技术的有益效果是：HIV的包膜蛋白是一种约160KD的糖蛋白(gp160)，在病毒感染宿主细胞过程中，gp160被宿主细胞蛋白酶裂解，形成gp120和整体膜蛋白gp41，gp41蛋白在病毒粒子的膜层中固定，gp120则固定在膜上段向周围环境突出，gp120多肽有助于介导HIV病毒进入宿主细胞。研究表明，HIV的感染机制是gp120与宿主表面的CD4相互作用，从而导致辅助受体结合位点(如V3环以及桥片层的形成和暴露)，进一步与辅助受体(CCR5或是CXCR4)的结合导致病毒膜和细胞膜的融合并使病毒进入，最终造成人类免疫细胞的大量死亡。CD4的结合能够使gp120结构更加紧凑和稳定的构象，降低了gp120结构的构象多样性，将gp120局限于有限的构象状态。根据此感染机制的启发，本专利技术采用HIV-1包膜多肽，将gp120与CD4类似物或CD4“迷你蛋白”连接在一起，即gp120-CD4，其构象发生改变并在CD4结合位点上暴露出抗原表位，使抗体识别并与暴露出的抗原相结合，从而刺激机体产生细胞免疫和体液免疫反应(见图1)。更详细的说，本专利技术具有如下优势：1、选取包膜蛋白gp120为抗原识别位点，该包膜蛋白为逆转录病毒所共有，也含有CTL和TH决定簇，既克服了HIV亚型多、变异快的缺点，又能激发特异性T细胞产生较强的免疫反应，促使机体产生更强的抗HIV的细胞免疫反应。2、首次将gp120与CD4类似物或CD4“迷你蛋白”连接在一起，即gp120-CD4，诱导ENV构象发生变化并在CD4受体结合位点上暴露出抗原表位，进而抑制病毒突变的免疫逃逸，并可诱导机体产生更强的体液免本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗HIV‑1基因，其特征在于：该基因由GM‑CSF核酸人工序列与gp120‑CD4模块串联组成，所述gp120‑CD4模块含有以下基因片段中的至少一条；(1)gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(2)gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(3)gp120(AE)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；当所述gp120‑CD4模块含有两条或以上的基因片段时，含有的所述基因片段串联。

【技术特征摘要】
1.抗HIV-1基因，其特征在于：该基因由GM-CSF核酸人工序列与gp120-CD4模块串联组成，所述gp120-CD4模块含有以下基因片段中的至少一条；(1)gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(2)gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(3)gp120(AE)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；当所述gp120-CD4模块含有两条或以上的基因片段时，含有的所述基因片段串联。2.如权利要求1所述的抗HIV-1基因，其特征在于：为以下基因序列顺序串联：GM-CSF核酸人工序列，如SEQIDNO.1；gp120(B)核酸人工序列，如SEQIDNO.2；G4S核酸人工序列，如SEQIDNO.5；CD4核酸人工序列，如SEQIDNO.6；gp120(C)核酸人工序列，如SEQIDNO.3；G4S核酸人工序列，如SEQIDNO.5；CD4核酸人工序列，如SEQIDNO.6；gp120(AE)核酸人工序列，如SEQIDNO.4；G4S核酸人工序列，如SEQIDNO.5；CD4核酸人工序列，如SEQIDNO.6。3.如权利要求2所述的抗HIV-1基因，其特征在于：采用包括如下步骤的方法合成：(1)分别按GM-CSF核酸人工序列、gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列、gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列、gp120(AE)核酸人...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明录，王立新，冯建海，金海锋，卢永灿，韩国英，马洪华，万磊，张传鹏，强邦明，刘敏，韩庆梅，王亮，
申请(专利权)人：山东兴瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37