一种提高蛋白表达效率的启动子制造技术

本发明专利技术公开了一种提高蛋白表达效率的启动子，属于启动子工程领域。本发明专利技术所述方法中涉及的启动子PBH4是在启动子PsrfA的基础上对其核心区进行突变改造而形成的。在新启动子PBH4控制转录下，表达绿色荧光蛋白(GFP)时，使用PBH4的表达量是使用PsrfA的3.5倍，表达葡糖醛酸酶A(GusA)时，使用PBH4使酶活从0.6U/ml提高至8.9±0.1U/ml。

A promoter to improve protein expression efficiency

The invention discloses a promoter for improving protein expression efficiency, which belongs to the field of promoter engineering. The promoter PBH4 involved in the method is formed by mutation and transformation of the core area on the basis of the promoter PsrfA. When the new promoter PBH4 was transcribed, the expression of green fluorescent protein (GFP) was expressed by PBH4 3.5 times as much as PsrfA, and when the glucuronoate A (GusA) was expressed, the enzyme activity was increased from 0.6U/ml to 8.9 + 0.1U/ml by using PBH4.

【技术实现步骤摘要】
一种提高蛋白表达效率的启动子
本专利技术涉及一种提高蛋白表达效率的启动子，属于启动子工程领域。
技术介绍
枯草芽孢杆菌表达系统被认为是GRAS级的有机体，可将功能性蛋白分泌到培养基中，分离纯化工艺简单，目前被广泛用作异源蛋白表达的宿主菌。枯草芽孢杆菌应用的最为广泛的宿主菌是枯草168菌株以及枯草168系列的突变株(如WB600，WB700，WB800等)，本专利技术中选择使用的宿主菌是Bacillussubtilis168。基因表达体系是一个复杂的过程，目前枯草表达系统还不是很成熟。近年来，科研工作者在枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白方面取得很大的进展，已建立一个有效的外源蛋白枯草表达系统。而在载体系统的改造过程中，启动子调控元件起着重中之重的作用，选用强启动子可以使克隆基因高水平表达。因此，从启动子出发，设计强启动子元件，构建成熟高效的枯草表达系统，无论是在理论研究还是实际生产中都有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种突变型枯草芽孢杆菌启动子以及利用该启动子在枯草芽孢杆菌168中高效表达外源蛋白的方法。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平有较大的影响，本专利技术以强启动子基因序列为基础，采用对启动子基因的核心元件进行定向进化的方式得到一个提高活力的突变启动子。该方法构建的新的启动子有效的提高了异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量。本专利技术的第一个目的是提供一种提高蛋白分泌表达效率的启动子，含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术的第二个目的是提供含有所述提高蛋白分泌表达效率的启动子的载体。本专利技术的第三个目的是提供一种蛋白表达效率提高的基因工程菌，是以含有所述提高蛋白分泌表达效率的启动子的载体表达蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白包括但不限于酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或合成酶。本专利技术的第四个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：(1)以权利要求1所述的启动子与载体连接或替换载体本身具有的启动子，得到含有新启动子的质粒新启动子；(2)将质粒新启动子与外源基因连接，得到含有新启动子的质粒新启动子-外源基因；(3)将质粒新启动子-外源基因转化到细菌或真菌细胞中。本专利技术的第五个目的是提供一种提高启动子分泌表达效率的方法，是对启动子-10区上游的核苷酸序列进行3～7bp突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变是-10区上游3bp碱基进行简并突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变是-10区上游3bp碱基进行简并突变，并在已突变3bp碱基的基础上对3bp碱基上游的4bp碱基再进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是以SEQIDNO.2所示的启动子为亲本序列，对-10区上游3bp碱基进行简并突变，并在已突变3bp碱基的基础上对3bp碱基上游相邻的4bp碱基再进行突变，获得SEQIDNO.1所示的突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变为简并突变。本专利技术的第六个目的是提供所述提高蛋白分泌表达效率的启动子在生产含蛋白的产品方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括制备葡糖醛酸酶A。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是将编码葡糖醛酸酶A的基因与含有所述提高蛋白分泌表达效率的启动子的载体连接，转化至宿主细胞中进行发酵。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码葡糖醛酸酶A的基因含有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌168。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵是在35～37℃下发酵8～52h。所述新型启动子，是PBH4。是以PsrfA为初始启动子构建得到的。所述质粒载体，在本专利技术中，是pBBH4-GFP和pBBH4-gusA。本专利技术的有益效果：本专利技术采用定向进化方式，获得了可提高外源蛋白产量突变体启动子PBH4，该启动子可以在枯草芽孢杆菌中高效表达外源基因。突变启动子PBH4转录活性较原始启动子PsrfA提高6倍以上，表达绿色荧光蛋白(GFP)时，使用PBH4的表达量是使用PsrfA的3.5倍，表达葡糖醛酸酶A(GusA)时，使用PBH4使最大酶活从0.6U/ml提高至8.9±0.1U/ml。附图说明图1：PsrfA启动子突变体库构建策略；图2：不同启动子在摇瓶水平上的表达能力验证a：生长曲线，b：GFP表达曲线，c：24h荧光强度比较，d：SDS-PAGE检测GFP表达量；其中WT为野生型启动子PsrfA表达GFP；BH4为突变体启动子PBH4表达GFP；图3：GusA在重组枯草芽孢杆菌中的表达；a：生长曲线与酶活测定，b：SDS-PAGE检测；其中，BSGus为野生型启动子PsrfA表达GusA；BSBHGuS为突变体启动子PBH4表达GusA。具体实施方式1、GFP荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入SynergyTMH4荧光酶标仪检测荧光。激发光495nm，吸收光525nm，检测荧光。2、GusA酶活检测方法：在96孔酶标板中，向50μL细胞裂解液中加入终浓度为0.5mg·mL-1的4-nitrophenylβ-d-glucuronide(PNPG)底物溶液(pH为7.0)，37℃反应5min。加入100μL终浓度为1M的Na2CO3终止反应。放入SynergyTMH4荧光酶标仪检测405nm下的吸光值。依据标准曲线计算酶活。酶活定义：在37℃，pH为7.0的条件下，每分钟转化生成1mmol产物对硝基苯酚所需酶量为一个酶活单位1U。3、培养基：LB培养基(L-1)：胰蛋白胨10g，NaCl10g，酵母提取物5g，pH7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。4、培养条件：重组菌种从-80℃冰箱中取出，在含有相应抗性的LB平板上划线，挑取单菌落在含有5mLLB培养基的试管中200r·min-1，37℃过夜培养。之后按2％接种量转入含有50mLLB培养基的250mL摇瓶中培养。5、枯草芽孢杆菌168转化方法：挑单菌落BS168接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养过夜；从过夜培养物中取100μL，接种至5mLSPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD600。当OD600约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPII培养基中，于37℃、100r·min-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μLl00×EGTA(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min-1摇床中培养10min后分装500μL每l.5mL离心管；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。实施例1：PsrfA启动子突变体库构建策略以PsrfA-3bp-1和PsrfA-3bp-2(表1)为引物，以pBSG03(公开于C.Guan,W.Cui,J.Cheng,L.Zhou,J.Guo,X.Hu,G.Xiao,Z.Zhou,Constructionanddeve本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种启动子，其特征在于，含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种启动子，其特征在于，含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.含有权利要求1所述启动子的载体。3.一种基因工程菌，其特征在于，权利要求2所述的载体表达蛋白。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述蛋白包括酶。5.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以权利要求1所述的启动子与载体连接或替换载体本身具有的启动子，得到含有新启动子的质粒新启动子；(2)将质粒新启动子与外源基因连接，得到含有新启动子的质粒新启动子-外源基因；(3)将质粒新启动子-外源基因转化到细菌或真菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，韩来闯，崔文璟，周丽，刘中美，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32