一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法技术

技术编号:17794503 阅读:36 留言:0更新日期:2018-04-25 17:57
本发明专利技术公开了一种以脂肪多胺型树形分子(PAMAM)和陶瓷颗粒为特征的新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法,包括裂解液LB、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液。本发明专利技术的最显著特征在于,同时添加脂肪多胺型树形分子及陶瓷颗粒,有效的提高了对蛋白、脂肪等杂质的去除,利用本发明专利技术试剂盒提取动物肝脏组织基因组核酸回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质。核酸提取从裂解、纯化到收集产物的全过程均可由仪器完成,自动化程度高,提取所使用的试剂高效安全,最大程度避免对人体的伤害。

A new nucleic acid extraction kit for animal liver and its extraction method

The invention discloses a new animal liver nucleic acid extraction kit and extraction method, which is characterized by PAMAM and ceramic particles, including LB, magnetic bead suspension, washing liquid and eluent. The most significant feature of the invention is to add the fatty polyamines and ceramic particles at the same time, effectively improve the removal of impurities, such as protein and fat, and use the kit to extract the genome of animal liver tissue with high nucleic acid recovery, high purity, complete fragment and no PCR suppressing substance. The whole process of nucleic acid extraction from lysis, purification and collection can be completed by instrument, high automation, high efficiency and safety of the reagents used, and the maximum degree of avoiding the harm to the human body.

【技术实现步骤摘要】
一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法
本专利技术属于分子生物学
,涉及一种以脂肪多胺型树形分子为特征的新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法。
技术介绍
核酸即(NucleicAcids)是遗传信息的载体,人们对基因进行重组、改造、进化分析、疾病诊断和基因治疗等都必须进行核酸的提取和纯化。因此核酸样品的提取和分离纯化是分子生物学各类实验不可缺少的一个环节。核酸的提取方法对检测过程和检测效果有很大影响。核酸提取是分子生物学的基本方法,也是核酸诊断中最关健的方法,它是下游诊断、分析和制备的前提。随着分子检测技术的广泛应用,核酸提取技术获得长足发展。第一代化学法,如异硫氰酸胍-酚-氯仿提取法、Trizol提取法等操作繁琐、耗时、易污染,对人员技术水平要求较高;第二代为吸附柱提取法操作较简单、提取效率高、提取质量稳定。近年发展起来的第三代磁珠提取法提取效率更高,且可进行仪器自动化批量提取,在有批量提取要求的实验室中广受推崇以核酸为研究对象的生物技术,包括对核酸的提取、克隆、扩增、检测、测序等一系列技术,近年来飞速发展,这些技术目前不仅在研究单位使用,而且在社会生活中多个职能部门已经广泛应用。然而,由于磁珠对蛋白质及脂肪也具有一定的吸附性,导致核酸提取液的纯度不佳,蛋白质和脂肪含量偏高。说明磁珠法核酸提取方法仍然有进一步增强其核酸提取效率的必要性。树形分子是一类三维、高度有序的齐聚物,由三个结构部分组成:中心核,内层支化单元和端基支化单元。树形分子具有像树一样的外表结构,在结构上具有高度的几何对称性,精确的分子结构和大量的官能团,分子内存在空腔且分子质量具有可控性。由于合成步骤是可控制的,因而分子结构相对传统线形大分子而言是单分散性的,而且结构参数如尺寸、外形、表面化学都可以在合成过程中得到完全控制。脂肪多胺型树形分子是树形分子中最典型的一种,其分子中有大量含N的官能团(伯胺、叔胺、酰胺等),而且这些官能团以规则的层状支化方式存在,并且其数量随分子代数的增加以几何级数的形式增加,具有对脂肪、蛋白质有良好的吸附性能。本专利技术选用了脂肪多胺型树形分子中的SG-TETA2作为吸附材料。SG-TETA2能与磁珠争夺对脂肪、蛋白质的吸附,且具有更强的吸附性,从而减少了磁珠对脂肪、蛋白质的吸附,并使得磁珠能吸附更多的核酸,进一步提高磁珠法核酸提取的效率和纯度。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术不足,提供一种更高效的提取高纯度动物肝脏组织核酸的试剂盒。本专利技术提供了一种以脂肪多胺型树形分子为特征的新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其特征在于,包括裂解液LB、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液四种组分。其中,裂解液LB包括:盐浓度≥4M的高浓度盐,10~30mg/ml脂肪多胺型树形分子,10~30mg/ml陶瓷颗粒,1~2%TritonX-100,20~60mM的pH为6.0~8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl),40~80mM乙二胺四乙(EDTA),所述高浓度盐选自下组中的任意一种:盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾,裂解液LB终PH=6-8。其中,洗涤液为:盐浓度≥10mM的盐,10~30mM的pH6.0~8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl),75%乙醇,所述盐选自下组中的任意一种:氯化钾、氯化钠。其中,磁珠悬液按每0.3~0.7mg磁珠分散于100μl20%~80%异丙醇的比例配制。优选地,磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠,磁珠直径在100-1000nm之间,具有核壳结构,即超顺磁性核心及氧化硅外壳。优选地,洗脱液为:DEPC处理水。优选的,脂肪多胺型树形分子为SG-TETA2。优选的,陶瓷颗粒直径在50-100微米之间。优选的,新型动物肝脏核酸提取试剂盒包含:(1)裂解液LB:4.5M异硫氰酸胍,15mg/ml脂肪多胺型树形分子,15mg/ml陶瓷颗粒,1.5%TritonX-100,30mM的pH为6.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl),50mM乙二胺四乙酸(EDTA),裂解液LB的最终终PH=6.4;(2)磁珠悬液:0.5mg磁珠分散于100μl20%异丙醇;(3)洗涤液:15mM氯化钠,20mM的pH6.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl),75%乙醇;(4)洗脱液:DEPC处理水。本专利技术的另一个目的是提供一种更高效的提取高纯度动物肝脏组织核酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)裂解与结合:将“7N”mg生物样品,加入到包含“20N”μL本专利技术的上述裂解液、“20N”μL异丙醇的1.5ml离心管中,充分混匀,室温放置8~10min,使细胞裂解并释放其中的核酸、蛋白质,再加入“N”μL磁珠溶液,游离的核酸在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面,最后通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁,吸弃离心管内溶液;(2)清洗:在离心管内加入“50N”μL含乙醇的洗涤液,充分混匀,第一次清洗磁珠,通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁,吸弃离心管内溶液,重复操作一次;(3)洗脱:在离心管内加入“2N~10N”μl洗脱液,充分混匀,56℃加热洗脱3~5min,使核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中,通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁,转移洗脱液至新的离心管内,即为提取好的核酸。步骤(1)的特征在于:1)所述“N”,10≤“N”≤15;2)所述裂解液含有脂肪多胺型树形分子及陶瓷颗粒,增强了去除蛋白质和脂肪的能力,且对磁珠的操作没有任何影响;3)所述的生物样品为动物肝脏组织。步骤(3)的特征在于:洗脱液的用量根据用户需要在20-150μl体积之间任选。本专利技术还提供了硅胶支撑的脂肪多胺型树形分子SG-TETA2制备方法,包括:(1)SG—TETA的合成:TETA,CPTS与甲醇混合,磁力搅拌,氮气保护下混合物回流12h,得到CPTS-TETA,蒸馏,然后加入活化硅胶,以甲苯为溶剂,机械搅拌,氮气保护下回流反应12h,洗涤,抽滤,回流萃取24h,真空干燥至少48h,得SG-TETA;(2)SG-TETA-MA的合成:SG-TETA,重蒸MA,甲醇混合,氮气保护下50度反应3d,反应结束后,抽滤,回流萃取24h,50度真空干燥至少48h,得到SG-TETA-MA。(3)SG-TETA2的合成:SG-TETA-MA,甲醇,TETA混合,氮气保护下50度反应5d,反应结束后,抽滤,回流萃取24h,真空干燥至少48h,得到SG-TETA2。制备得到的SG-TETA2的分子结构和制备流程如图1所示。本专利技术的有益效果在于:1)由于加入了脂肪多胺型树形分子和陶瓷颗粒,使得利用本专利技术试剂盒提取的核酸回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质。使用本试剂提取70mg猪肝脏、小鼠肝脏组织,分别纯化得到了约11μg和8μg的高纯度核酸,纯度A260/280=1.8-1.9之间。2)本专利技术还发现与常规的磁珠法,或单独加入脂肪多胺型树形分子或陶瓷颗粒相比,同时加入脂肪多胺型树形分子和陶瓷颗粒,具有协同增强的分离作用,有效的提高了对蛋白、脂肪等杂质的去除;3)本专利技术的DNA提取方法仅需3个步骤,分别是裂解与结合、清洗、洗脱,从裂解、纯化到收集产物的全过程均可由仪器完成,自动化程度高,实验过程中完全无需人工干本文档来自技高网
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一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法

【技术保护点】
一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其特征在于,包括裂解液LB、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液;所述裂解液LB包括:盐浓度≥4M的高浓度盐,10~30mg/ml脂肪多胺型树形分子,10~30mg/ml陶瓷颗粒,1~2%Triton X‑100,20~60mM的pH为6.0~8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑Cl),40~80mM乙二胺四乙(EDTA),所述高浓度盐选自下组中的任意一种:盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾,所述裂解液LB的最终PH为6‑8;所述洗涤液包括:盐浓度≥10mM的盐,10~30mM的pH6.0~8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑Cl),75%乙醇,所述盐选自下组中的任意一种:氯化钾、氯化钠;所述磁珠悬液按每0.3~0.7mg磁珠分散于100μl 20%~80%异丙醇的比例配制。

【技术特征摘要】
1.一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其特征在于,包括裂解液LB、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液;所述裂解液LB包括:盐浓度≥4M的高浓度盐,10~30mg/ml脂肪多胺型树形分子,10~30mg/ml陶瓷颗粒,1~2%TritonX-100,20~60mM的pH为6.0~8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl),40~80mM乙二胺四乙(EDTA),所述高浓度盐选自下组中的任意一种:盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾,所述裂解液LB的最终PH为6-8;所述洗涤液包括:盐浓度≥10mM的盐,10~30mM的pH6.0~8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl),75%乙醇,所述盐选自下组中的任意一种:氯化钾、氯化钠;所述磁珠悬液按每0.3~0.7mg磁珠分散于100μl20%~80%异丙醇的比例配制。2.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其中洗脱液为:DEPC处理水。3.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其中脂肪多胺型树形分子为SG-TETA2。4.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其中陶瓷颗粒直径在50-100微米之间。5.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其中试剂盒包含:(1)裂解液LB:4.5M异硫氰酸胍,15mg/ml脂肪多胺型树形分子,15mg/ml陶瓷颗粒,1.5%TritonX-100,30mM的pH为6.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl),50mM乙二胺四乙酸(EDTA),裂解液LB的最终终PH=6.4;(2)磁珠悬液:0.5mg磁珠分散于100μl20%异丙醇;(3)洗涤液:15mM氯化钠,20mM的pH6.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl),75%乙醇;(4)洗脱液:DEPC处理水。6.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其中所述磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠,磁珠直径在100-1000nm之间,具有核壳结构,即超顺磁性核心及氧化硅外壳。7.一种高效的提取高纯度动物肝脏组织核酸的方法,其...

【专利技术属性】
技术研发人员:王科媛
申请(专利权)人:宁波卡尔新材料科技有限公司
类型:发明
国别省市:浙江,33

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