一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,ZnSOD的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn SOD的制备方法及其应用，该方法通过提取Paelopatides sp.的总RNA，经RT‑PCR反转录为cDNA，通过PCR扩增获得了编码超氧化物歧化酶的基因序列PaSOD，在pColdⅡ载体中构建原核表达重组质粒，导入大肠杆菌Chaperone Competent Cell pG‑KJE8/BL21中进行重组蛋白可溶性表达，通过该方法制备的重组蛋白克服了原料来源难以获取、蛋白变复性回收过程复杂繁琐等不足，纯化后的蛋白纯度高、活力好，温度适应范围广，能够抵御高浓度的消化酶消化，为该蛋白广泛应用于生物、食品、医药、美容等领域奠定基础。

Preparation method and application of superoxide dismutase Cu, ZnSOD from deep sea sea cucumber

The invention discloses a method for the preparation and application of superoxide dismutase Cu, Zn SOD, which is the source of abyssal sea cucumbers. By extracting the total RNA of Paelopatides sp. and reverse transcription of RT PCR as cDNA, the gene sequence PaSOD of the superoxide dismutase is obtained by PCR amplification, and the expression of the prokaryotic expression in the pCold II carrier is constructed. Recombinant plasmids were introduced into Competent Cell pG KJE8/BL21 KJE8/BL21 for soluble expression of recombinant protein. The recombinant protein prepared by this method overcame the difficulty of obtaining raw materials and complicated and complicated process of recovery of protein complex. The purified protein was of high purity, good vitality and temperature adaptation range. It can resist the digestion of high concentration digestive enzymes, and lay the foundation for the wide application of this protein in biology, food, medicine, cosmetology and so on.

【技术实现步骤摘要】
一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,ZnSOD的制备方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,ZnSOD的制备方法及其应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)简称SOD，是一种广泛存在于自然界的生物酶，按所含金属种类不同可分为铜锌SOD、锰SOD、铁SOD以及镍SOD等几种。现在市场上出售的SOD大多都从血液中提取，属铜锌SOD(Cu,Zn-SOD)。Cu,Zn-SOD分子由两个亚基组成，每个亚基含有一个铜离子和一个锌离子，分子量在32000Da左右。SOD是一种生物酶，其化学本质是蛋白质，国内外对其毒性进行了广泛的研究。实验表明，它对人体无毒副作用，是一种纯天然的生物活性物质。Cu,Zn-SOD是一种特殊的生物酶，因此具有许多特殊的功能，当前地球生存环境日益恶化，诱发产生大量自由基，对人体健康产生影响。研究表明，通过适量补充摄入SOD，人体可能通过一些特殊的消化吸收机制，使得一定量SOD进入人体发挥功能，从而有效保护人体细胞不受到过量氧自由基的破坏，延缓细胞的衰老过程，延长寿命(CicekE,YildizM,DelibasN,etal.Theeffectsof201Tlmyocardialperfusionscintigraphystudiesonoxidativedamageinpatients[J].WestIndianMedicalJournal,2009,58(1):50.)。此外，国内外SOD的应用还集中在作为药用酶原料、化妆品的添加剂、功能食品的强化剂等几个方面。目前SOD应用技术的主要瓶颈仍然是传统的动植物提取出来的SOD存在稳定性较差，活性难以保持等。因此，开发高效优质SOD基因，利用基因工程菌发酵生产提取SOD势在必行。深渊生物生存环境恶劣，由于受到采样技术和样品保存的限制，目前对其功能基因的开发存在国内外研究匮乏的现象。对其SOD的报道也相对较少，尤其是Cu，Zn-SOD。另外，目前通常使用的蛋白表达制备方法多以包涵体的方式进行，表达的蛋白常常没有活性，不可回收或者要进行变复性回收。存在成功率低，操作繁琐，耗时长，酶活损失大等缺点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对目前SOD稳定性较差，活性难以保持，优质SOD基因难以获取、蛋白变复性回收过程复杂繁琐等不足的问题，提供了一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD及其制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种深渊海参Paelopatidessp.来源的超氧化物歧化酶的编码蛋白，其具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或同等功能的氨基酸序列。本专利技术还公开了一种编码上述蛋白的基因。进一步地，其具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术还公开了一种含有上述基因的pColdⅡ载体。本专利技术还公开了一种含有上述载体的ChaperoneCompetentCellpG-KJE8/BL21表达宿主细胞。本专利技术还公开了一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD的制备方法，具体按照以下步骤实施：步骤1、Paelopatidessp.总RNA及cDNA的获得；步骤2、Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD基因的获得和序列分析；步骤3、Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD基因的可溶性表达与纯化。进一步地，所述步骤2中的Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD基因的获得中所用的到的PCR反应体系为50μL，包括10μLPrimeSTARGXLBuffer，4μLdNTP，F和R引物各1μL，模板cDNA1μL，2μLGXLDNAPolymerase(TaKARa公司)，用H2O将总体积补至50μL。进一步地，所述PCR反应体系中的引物对为引物F和引物R，其中，引物F：CGGGATCCATGTCTGTCCACGCCGTTTGTGTATT，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；引物R：AACTGCAGTATCTTTTTGATCCCAATTACA，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；划线部分GGATCC代表BamHI酶切位点，CTGCAG代表PstI酶切位点。进一步地，所述步骤2中的Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD基因的获得中所用的到的PCR反应条件为：98℃10s、55℃15s、68℃10s，30cycles，4℃保存。进一步地，所述步骤3中的纯化采用Ni-NTA柱纯化。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：通过该方法制备的重组蛋白克服了原料来源难以获取、蛋白变复性回收过程复杂繁琐等不足，纯化后的蛋白纯度高、活力好，温度适应范围广，消化酶耐受性强，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、美容、农业等领域奠定基础。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD基因重组表达的SDS-PAGE电泳图谱；其中，M:蛋白Marker；1：重组载体pColdⅡ在ChaperoneCompetentCellpG-KJE8/BL21的未诱导表达；2：重组载体pColdⅡ在ChaperoneCompetentCellpG-KJE8/BL21的诱导表达；3：重组质粒pColdⅡ在ChaperoneCompetentCellpG-KJE8/BL21中诱导表达后超声破碎后包涵体；4：重组质粒pColdⅡ在ChaperoneCompetentCellpG-KJE8/BL21中诱导表达后超声破碎后上清；5：经镍柱介质纯化所得的目的蛋白PaSOD；图2是本专利技术Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD的热稳定性曲线图；其中，横坐标表示不同温度，纵坐标表示PaSOD的相对活性；图3是本专利技术Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD的酸碱稳定性曲线图，其中，横坐标表示不同pH，纵坐标表示PaSOD的相对活性。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子克隆实验室手册(15、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议操作说明书条件进行。为实现上述目的，本专利技术采用以下具体措施，其具体步骤是：实施例1深渊海参Paelopatidessp.总RNA及cDNA的获得：深渊海参Paelopatidessp.采自于马里亚纳海沟6500m的深渊(纬度：10°57.1693’N，经度：141°56.1719’E)，样品原位加入RNAlater进行研磨后，立即用液氮保存。回实验室后，取50-100mg样品组织，使用RNaseFREE实验用纸吸干残留的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn SOD的编码蛋白，其特征在于，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,ZnSOD的编码蛋白，其特征在于，其具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述蛋白的基因，记做PaSOD。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述基因的pColdⅡ载体。5.含有权利要求4所述载体的ChaperoneCompetentCellpG-KJE8/BL21表达宿主细胞。6.一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1、Paelopatidessp.总RNA及cDNA的获得；步骤2、Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD基因的获得和序列分析；步骤3、Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD基因的可溶性表达与纯化。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaSOD基因的获得中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亚男，张海滨，孔雪，刘君，刘合露，
申请(专利权)人：中国科学院深海科学与工程研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46