一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术揭示了一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种及其筛选方法和应用。本发明专利技术的菌种可以应用于制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，以烟酰胺核糖为底物溶液，以所述菌种的细胞粗提物为催化剂加入到底物中，再加入三磷酸腺苷氨酸，转化18小时后，标准溶液中形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。本发明专利技术提供的菌种可一步催化得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，产率高。

A strain capable of catalyzing nicotinamide adenine dinucleotide and its screening method and Application

The invention discloses a strain capable of catalyzing nicotinamide adenine dinucleotide, and screening method and application thereof. The bacteria of the present invention can be used to prepare nicotinamide adenine dinucleotide, use nicotinamide ribose as a substrate solution, add the cell crude extract of the strain into the substance, and then add adenosine triphosphate aspartate, and then form a nicotinamide adenine dinucleotide in the standard solution after 18 hours transformation. The strain provided by the invention can produce nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) by one-step catalysis with high yield.

【技术实现步骤摘要】
一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种及其筛选方法和应用
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种利用微生物细胞或细胞粗提物酶促合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。
技术介绍
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide，缩写NAD，也称之为辅酶I）是一种基本的氧化还原辅酶，在细胞中起着核心的枢纽作用，参与细胞物质代谢、能量合成、呼吸作用等核心基础生理活动。在体外氧化还原类型的生物催化反应中，很多氧化还原反应的主酶同样需要各种辅酶的参与才能正常反应。NAD是一类较为常见的辅酶，目前已知有约七百种酶可以利用辅酶NAD进行催化。因此，在氧化还原类的工业生物催化反应中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的工业制备尤为重要。目前，制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的方法有多种，包括化学合成、生物酶催化及酵母菌发酵提取等。化学合成法由于化工所固有的污染严重，条件苛刻，加之得率不高，合成成本较高。对于酵母菌发酵提取的方法，由于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)在酵母菌中的含量过低，因此该方法在工业制备规模上具有很大的局限性。生物酶催化因为其固有的高效率、绿色环保等优点逐渐成为工业制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的主流方法。生物酶催化制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)主要包括下列主要步骤：第一步：以烟酰胺核糖(nicotinamideriboside,NR)为起始底物，在烟酰胺核糖激酶(nicotinamideribosidekinase,NRK)的催化下，得到烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononucleotide,NMN)。该反应过程反应式如下：第二步：烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononucleotide,NMN)在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nicotinamidemononucleotideadenylyltransferase,NMNAT)的作用下，与另一前体三磷酸腺苷(ATP)反应，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。但上述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物酶催化制备方法涉及多步反应，且得率不高。
技术实现思路
鉴于现有技术存在上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种高收率的制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的方法，具体的为提供一种土壤中筛选得到的菌种，能以烟酰胺核糖(nicotinamideriboside,NR)为起始底物，一步催化得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。本专利技术的目的，将通过以下技术方案得以实现：一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种，所述菌种为DHP02，分类命名为变形杆菌Proteussp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，北京科学院微生物研究所，保藏编号CGMCCNO：13721，保藏时间2017年3月3日。优选地，所述的一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种在制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸上的应用。优选地，所述的一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种在制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸上的应用，包括如下步骤，以烟酰胺核糖为底物溶液，以所述菌种的细胞粗提物为催化剂加入到底物中，再加入三磷酸腺苷氨酸，转化18小时后，标准溶液中形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。优选地，以上所述细胞粗提物为所述菌种进行LB培养基富集培养制得，所述LB培养基为丰富培养基，配方为：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠0.5%。优选地，一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种的筛选方法，包括如下步骤，S1、系统取样驯化步骤，在长期进行烟酰胺核糖合成处取土壤作为取样点，加入无机盐液体培养基和烟酰胺核糖溶液，并调节体系pH为6.6-7.2，驯化培养7天形成土壤悬液；S2、固体筛选培养基制作步骤，在S1中的培养基中加入琼脂粉进行高温灭菌后冷却至室温形成固定培养基备用；S3、菌液涂布步骤、将S1中驯化后的土壤悬液涂布于S2中的固定培养基中进行培养48小时；S4、接种步骤，在S3中随机选择分离良好的单菌落，进行接种挑取，接种至S1中的无机盐液体培养基中；S5、菌种分离步骤，在S3中选取能长出微生物的液体培养基进行菌种分离纯化；S6、将S4中能长出微生物的液体培养基取出，重复S3的涂布步骤，并置于恒温箱培养；S7、菌落的形成，重复S4-S6步骤，进行固体—液体—固体”的连续传代培养，直至固体培养基中形成肉眼观察到的菌落形态一致或显微镜下观察到的细胞形态一致。优选地，所述S1中无机盐液体培养基的配方为：本专利技术的有益效果：本专利技术提供的菌种可一步催化得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，产率高。以下便结合实施例附图，对本专利技术的具体实施方式作进一步的详述，以使本专利技术技术方案更易于理解、掌握。附图说明图1：对照组的高效液相色谱反应图谱。图2：本专利技术中筛选制得菌种催化得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的高效液相色谱反应图谱。具体实施方式实施例1在长期进行烟酰胺核糖(nicotinamideriboside,NR)合成的工厂，选择下水道经过的土壤的5个取样点，平均每个点取土壤样品5g，加入200mL的无机盐培养基和烟酰胺核糖(nicotinamideriboside,NR)溶液，调节整个体系的pH为6.8，驯化培养7天。所述无机盐培养基即为以烟酰胺核糖(nicotinamideriboside,NR)作为唯一碳源的液体筛选培养基。其成分配比及烟酰胺核糖的用量、浓度等见表1。所述驯化培养条件为：将已加入无机盐培养基及烟酰胺核糖的土壤溶液装入500mL灭菌三角瓶中，用灭菌的八层纱布封口，置于避光的恒温摇床培养箱中，设置培养温度30℃，150rpm的转速进行驯化培养。表1：驯化培养基配方：。实施例2：制作固体筛选培养基：在表1的液体培养基配方的基础上，加入2%的琼脂粉，121℃高温灭菌25分钟后，放置冷却至45℃左右备用。取直径90mm的玻璃平皿，向平皿中倒入上述培养基20mL。继续冷却至室温直至培养基呈凝固状态。置于4℃冰箱中备用。该固体培养基即为以烟酰胺核糖(nicotinamideriboside,NR)作为主要碳源的固体筛选培养基。实施例3菌液涂布：取实施例1中驯化过的土壤悬液200μL，均匀涂布于实施例2中的固体筛选培养基中，置于恒温培养箱中培养，设置温度30℃，涂布后的平板倒置培养48小时。实施例4观察实施例3中培养了48小时的固体培养基表面。随机选择分离良好的单菌落，用接种针挑取，分别接种至实施例1所述液体培养基中培养，设置转速150rpm，温度30℃。实施例5观察实施例4中液体培养基长出的情况，取样进行显微镜观察，对于能长出大量微生物的液体培养基进行下一步菌种分离纯化工作。实施例6将实施例5中长出大量微生物的液体培养基取出200μL，按照实施例3中的方法，涂布到实施例2中的固体培养基表面。置于恒温培养箱中培养，设置温度30℃，涂布后的平板倒置培养48小时。实施例7重复实施例4至实施例6的步骤，进行“固体—液体—固体”的连续传代培养，直到在固体培养基下肉眼观察到的菌落形态一致或在显微镜下观察到的细胞形态一致。本专利所用筛选方法是：使用烟酰胺核糖(nicotinamideriboside，NR)作为培养基中的唯一碳源，能在此培养基中生长出来的微生物，理论上均是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种，其特征在于：所述菌种为DHP02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，北京科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO：13721，保藏时间2017年3月3日。

【技术特征摘要】
1.一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种，其特征在于：所述菌种为DHP02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，北京科学院微生物研究所，保藏编号CGMCCNO：13721，保藏时间2017年3月3日。2.如权利要求1所述的一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种在制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸上的应用。3.如权利要求2所述的一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种在制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸上的应用，其特征在于：包括如下步骤，以烟酰胺核糖为底物溶液，以所述菌种的细胞粗提物为催化剂加入到底物中，再加入三磷酸腺苷氨酸，转化18小时后，标准溶液中形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。4.如权利要求3所述的一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种在制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸上的应用，其特征在于：所述细胞粗提物为所述菌种进行LB培养基富集培养制得，所述LB培养基为丰富培养基，配方为：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠0.5%。5.如权利要求1所述的一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤，S1、系统取样驯化步骤，在长期进行烟酰胺核糖合成处取土壤作为取样点，加入无机盐液体培养基和烟酰胺核糖溶液，并调节体系pH为6.6-7.2，驯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：余宏，陈涛，王波，
申请(专利权)人：苏州东和盛昌生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32