一种基于微流控技术的仿生肠模型的构建方法技术

一种基于微流控技术的仿生肠模型的构建方法，应用于体外肠模型的构建。该制备方法制得的微流控芯片主要由上层芯片、多孔滤膜、下层芯片组成，上层芯片接种有肠细胞，施加以前行、后行交替向前的流体，在接种有肠细胞的微通道内形成一种蠕动流，利用这种蠕动流模拟体内肠道内的实际流体情况，对肠功能具有更好的促进效果。对于实现体外仿真环境的肠芯片，进行药物评价的应用等具有重要意义。

A method of constructing a bionic intestinal model based on microfluidics technology

A method of constructing a bionic intestinal model based on microfluidics is applied to the construction of an in vitro intestinal model. The microfluidic chip made by the preparation method is mainly composed of the upper layer chip, the porous filter membrane and the lower layer chip. The upper chip is inoculated with intestinal cells, and the fluid is applied with the forward and later lines, and a peristaltic flow is formed in the microchannel inoculated with the intestinal cells, and the actual fluid in the intestinal tract is simulated by this peristaltic flow. The situation has a better effect on intestinal function. It is of great significance for the realization of in vitro simulation of intestinal microarray and the application of drug evaluation.

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控技术的仿生肠模型的构建方法
本专利技术涉及一种仿生肠模型的构建方法，具体涉及一种基于微流控技术的仿生肠模型的构建方法。
技术介绍
动物实验在现代医学与生物学中占据了极为重要的位置，但是经费以及动物伦理也成了难以回避的问题。结合微流控技术与生物科学技术，创造出了一种“器官芯片”，能够用微芯片复制人体器官的功能，使医学实验变得更为简便。口服给药作为一种传统的给药方式，以其相对的方便性与安全性而为人们所广泛接受。吸收过程是决定口服药物生物利用度的关键因素之一。而小肠是口服药物吸收的主要部位，所以目前国内外主要利用各种体外及在体肠吸收模型研究药物在小肠部位的跨膜转运过程，从而预测其口服吸收情况。其中，Caco-2单层细胞模型是目前被广泛应用于研究药物分子的生物膜通透性和跨膜转运机制的体外模型之一，已经成为研究药物吸收特征的代表性体外研究体系，这个体系大都应用Transwell小室进行研究，在这种静态的培养条件下，细胞的培养周期要21天才可进行相关实验。微流控芯片实验室又称芯片实验室或微流控芯片，指的是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代生物仿生和细胞研究的重要平台。微流控芯片的结构特征在于各种复杂的微通道网络。微流控系统需要通过在这些微通道网络中对微流体的操作来实现各种功能，比如试剂的引入、混合、分离等。因此，微流控系统中的流体驱动技术是实现微流控芯片功能的关键技术。微流控系统采用各种类型的微泵来驱动流体，实际应用中对于微泵的基本要求是：能提供连续稳定的流量、结构简单、需要的辅助部件少、操作简便、制作和运行成本低。目前已有大量文献报道利用微流控技术构建肠芯片，在有施加流体的条件下，可以快速促进肠细胞的绒毛分化，大大缩短细胞培养周期。但是，实际上人肠道具有复杂的运动方式包括紧张性收缩、分节运动、蠕动等，所以肠道的流体并不是简单的直流，而是一种复杂的蠕动流。我们采用前行、后行交替向前的形式，在微流控芯片的微通道内模拟形成一种蠕动流，利用这种蠕动流可以呈现流体的双向剪切力，更好地促进肠细胞功能的完善，增加微通道内流体停留时间，增加流体接触面积，获得更好的流体混合效果，模拟更好的吸收功能等，这些都更符合实际情况。目前，还没有利用蠕动流构建肠模型进行相关研究，在生物学研究及医药研发中这种仿生肠芯片具有极大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种体外仿生肠模型的构建方法，这种方法构建的肠芯片可以更快地实现肠功能的模拟，肠吸收功能更加优化。本专利技术提供一种体外仿生肠模型的构建方法，一种微流控芯片，该微流控芯片主要由上层芯片、多孔滤膜、下层芯片组成；上层芯片由S形的上层芯片通道和上层芯片通道入口连接而成，下层芯片由S形下层芯片通道、下层芯片通道入口连接而成，上层芯片通道通过多孔滤膜(3)下连下层芯片通道。一种微流控芯片，所述上层芯片的通道与下层芯片通道空间位置重合连接。本专利技术提供一种体外仿生肠模型的构建方法，采用上述芯片，按照以下方法构建而成：(1)芯片预处理设计制作芯片，胶原处理芯片通道；(2)细胞的接种与培养肠细胞调整至1～5×106cells/mL的细胞悬液，加入上层芯片主通道，细胞贴附于多孔滤膜界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、12h后应用微流体驱动方法进行持续灌流；(3)待细胞生长状态良好，可进行相关试验。所述微流体驱动方法，应用控制泵操控流体的方法，在肠芯片上应用前行与后行交替向前流体。所述的微流体驱动方法，所述控制泵能够进行不同参数的调节机程序设定。本专利技术提供的体外仿生肠模型，所述肠芯片为在微流控芯片集成有肠细胞以模拟相肠功能的芯片。本专利技术提供的肠芯片上的微流体驱动方法，在微流控芯片的微通道内形成一种蠕动流，利用这种蠕动流可以呈现流体的双向剪切力，这种双向剪切力更符合对于某些细胞在体内的微环境，可以更好地促进细胞的生长，得到更好的细胞功能。蠕动流也可以增加微通道内流体停留时间，增加流体接触面积，获得更好的流体混合效果，在药物应用时可以更好地促进药物利用。本专利技术提供的仿生肠模型，在5天时便可形成可进行药物评价的功能完善的肠模型。附图说明图1本专利技术肠芯片示意图；a上层芯片通道结构示意图；b下层芯片通道结构示意图；c肠芯片整体俯视示意图；d肠芯片横截面示意图。(1)上层芯片通道，(2)多孔滤膜，(3)肠细胞，(4)下层芯片通道，(5)上层芯片通道入口，(6)下层芯片通道入口。图2本专利技术肠模型肠功能表征；a肠绒毛电镜图，b碱性磷酸酶分布图，c细胞活力图，d肠细胞紧密连接染色图，e肠屏障表观渗透系数，f肠屏障跨膜电阻。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。一种微流控芯片，如图1所示，该微流控芯片主要由上层芯片、多孔滤膜、下层芯片组成；上层芯片由S形的上层芯片通道1和上层芯片通道入口2连接而成，下层芯片由S形下层芯片通道4、下层芯片通道入口5连接而成，上层芯片通道1通过多孔滤膜3下连下层芯片通道4。所述上层芯片的通道1与下层芯片通道4空间位置重合连接。实施例1仿生肠模型的构建及其表征设计制作芯片，胶原处理芯片通道；肠细胞调整至1～5×106cells/mL的细胞悬液，加入上层芯片通道，细胞贴附于多孔滤膜界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、12h后应用微流体驱动方法进行持续灌流。设定控制泵参数为前行9s，后行3s交替循环前行，流速为1μL/min，实际效果为0.5μL/min，灌流培养作为PF组。静态条件培养模拟Transwell作为对照组Staic。培养5天时对各组进行肠模型的功能表征。使用扫描电镜对各组肠细胞进行表面结构表征，结果如图2a所示，可见仿生肠模型绒毛形态较明显，而对照组未见明显绒毛结构，建立的仿生肠模型具有较好的绒毛形态。使用试剂盒测量上层芯片培养液与下层芯片培养液的碱性磷酸酶含量，结果如图2b所示，可见仿生肠模型PF组肠细胞绒毛侧(AP)的碱性磷酸酶含量高于基底侧(BP)，而对照组两侧差异不大。使用CCK-8试剂盒测量肠细胞活力，结果如图2c所示，可见仿生肠模型PF组肠细胞细胞活力要高于对照组。使用免疫染色观察肠细胞紧密连接蛋白ZO-1的表达情况，结果如图2d所示，可见仿生肠模型PF组肠细胞具有明显的紧密连接蛋白表达，而对照组紧密连接表达较弱且杂乱未成形。培养每天测量肠屏障的跨膜电阻，结果如图2e所示，可见仿生肠模型PF组肠细胞屏障跨膜电阻值在5天时趋于平台值约为2500Ω*cm2,明显高于对照组平台值1000Ω*cm2左右。使用荧光素钠加入上层芯片通道，检测1小时内荧光素钠在肠模型的通透性，结果如图2f所示，可见仿生肠模型PF组肠细胞的通透屏障性要高于对照组。所建立的仿生肠模型具有更好的功能。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由上层芯片、多孔滤膜、下层芯片组成；上层芯片由S形的上层芯片通道(1)和上层芯片通道入口(5)连接而成，下层芯片由S形下层芯片通道(4)、下层芯片通道入口(6)连接而成，上层芯片通道(1)通过多孔滤膜(2)下连下层芯片通道(4)。

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由上层芯片、多孔滤膜、下层芯片组成；上层芯片由S形的上层芯片通道(1)和上层芯片通道入口(5)连接而成，下层芯片由S形下层芯片通道(4)、下层芯片通道入口(6)连接而成，上层芯片通道(1)通过多孔滤膜(2)下连下层芯片通道(4)。2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述上层芯片通道(1)与下层芯片通道(4)空间位置重合连接。3.一种基于微流控技术的仿生肠模型的构建方法，其特征在于，采用上述芯片，按照以...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，李中玉，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21