一种基于微流控芯片的肾小球体系及其应用制造技术

一种基于微流控芯片的肾小球体系及其应用，该微流控芯片由左侧主通道、右侧主通道、胶原通道、胶原通道入口、左侧主通道入口以及右侧主通道入口组成，胶原通道左连左侧主通道，右连右侧主通道。在左侧主通道接种肾小球微组织，右侧主通道作为收集区，可以观察肾小球的滤过作用，以及化学成分造成的肾毒性对肾小球滤过功能的影响。实现体外具滤过功能的肾小球芯片的构建，及其在药物的肾毒性评价应用。

A microfluidic chip based glomerular system and its application

A microfluidic chip based glomerular system and its application. The microfluidic chip is composed of the left main channel, the right main channel, the collagen channel, the collagen channel entrance, the left main channel entrance and the right main channel entrance, the left side main channel of the collagen channel and the right side of the right side main channel. The glomerular microtissue was inoculated on the left main channel, and the right main channel was used as a collection area to observe the filtration effect of the glomeruli and the effect of the chemical composition of renal toxicity on the glomerular filtration function. Objective to construct a glomerular chip with filtration function in vitro and its application in nephrotoxicity evaluation of drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片的肾小球体系及其应用
本专利技术涉及将微流控芯片技术应用到体外器官模型构建的
，具体涉及一种基于微流控芯片的肾小球体系及其应用。
技术介绍
肾脏是药物毒副作用的主要靶器官之一。肾脏由超过20种具有不同超微结构、代谢能力和转运功能的细胞构成，是药物排泄的重要器官。化学药物经肾脏排泄时会选择性地富集在肾细胞中，造成细胞膜、线粒体、内质网和溶酶体损伤，破坏细胞的完整性，使肾细胞凋亡或坏死。降低肾小球的滤过作用和肾小管的重吸收功能，进而造成体内水和电解质的不平衡，严重时还会引起急性肾衰竭。因此，观察药物肾毒性是药物安全性评价和药物毒理学研究的重要内容。现代药物毒理学研究开始由体内研究向体内和体外研究相结合发展，利用体内和体外技术，在整体、器官、细胞、亚细胞和分子水平等多个层次研究药物的肾毒性。在药物肾毒性的体外研究中，建立肾脏体外模型并将其应用于药物体外肾毒性评价与筛选已逐步成为热点。简单的进行肾细胞的体外培养进行相关评价已有大量的工作，大部分集中在简单的细胞毒作用，还不能在体外再现肾的滤过功能，构建具有功能的体外肾模型仍具很大的挑战。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。应用微流控技术构建具有功能的肾小球芯片具有十分重要的优势和意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于微流控芯片的肾小球体系及其应用；该方法能够实现对细胞功能的体外评价。一种微流控芯片，该微流控芯片由左侧主通道、右侧主通道、胶原通道、胶原通道入口、左侧主通道入口以及右侧主通道入口组成，胶原通道左连左侧主通道，右连右侧主通道。所述左侧主通道为I形或U形，所述芯片的右侧主通道为U型，所述胶原通道为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧主通道和右侧主通道连接，横向结构的数量为1～10个；胶原通道与左侧主通道的交界为半球形界面，胶原侧为凹面。所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为具微结构的可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃或不具结构的可透光透气的PDMS聚合物。所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道、右侧主通道高度为200～500μm，胶原通道高度为80～200μm，主通道高度：胶原通道高度为1～3:1。一种基于微流控芯片的的肾小球体系，采用上述微流控芯片，该肾小球体系按以下步骤构建：(1)芯片预处理设计制作芯片，用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道，室温30min固化，将培养基引入主通道。(2)肾小球的接种与培养提取原代大鼠肾小球微组织，调整至104～105cells/mL的细胞悬液，加入左侧主通道，侧立培养过夜，在光学显微镜下观察可见肾小球微组织贴附于胶原界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次。一种基于微流控芯片的的肾小球体系的应用，该体系用于以下方面：(1)使用CCK-8试剂盒进行细胞活性的检测，按CCK-8试剂：细胞培养基的体积比为1:9混合均匀成检测工作液，加入左侧主通道，置培养箱中3小时后，转入96孔板中，酶标仪测定450nm处吸光度，可以对细胞活力进行定量，作为药物毒性的指标之一；(2)LDH漏出，收集芯片通道内细胞培养液，使用LDH试剂盒，操作检测LDH浓度，观察药物对细胞的损伤程度，作为药物毒性的指标之一；(3)免疫荧光，常规免疫染色操作，荧光显微镜观察拍照，可以进行Live/Dead染色，观察细胞活力；ZO-1染色，观察细胞紧密连接情况；F-actin染色，观察细胞骨架等作为药物毒性的指标；(4)蛋白滤过，使用白蛋白标准液，加入左侧主通道，1小时后，收集右侧主通道培养液，白蛋白试剂盒操作检测蛋白浓度，观察中分子量白蛋白的滤过率，作为药物对肾滤过功能影响的指标；(5)蛋白滤过，使用Igg，加入左侧主通道，荧光显微镜下于0min、15min、30min、60min拍照，分析Igg渗透性，观察高分子量蛋白的滤过率，作为药物对肾滤过功能影响的指标。本专利技术提供的一种基于微流控芯片的肾小球体系及其应用，构建了一个能够模拟肾小球滤过功能的肾毒性评价平台，在左侧主通道接种肾小球微组织，右侧主通道作为收集区，可以观察肾小球的滤过作用，以及化学成分造成的肾毒性对肾小球滤过功能的影响。实现体外具滤过功能的肾小球芯片的构建，及其在药物的肾毒性评价应用。不但能够测试药物的肾毒型，同时能够实现在体外评价肾滤过功能。以此平台进行药物评价，获得的数据更符合人的实际情况，降低因为研发前期药物毒性数据不可靠导致的药物研发后期的失败率。附图说明图1本专利技术微流控芯片制作流程图，图2本专利技术微流控芯片结构示意图；其中a为胶原通道结构示意图，b为主通道结构示意图，c为芯片俯视示意图，d为胶原界面放大示意图，f专利技术微流控芯片横截面示意图；其中：1左侧主通道，2肾小球，3胶原通道，4右侧主通道，5胶原通道入口，6左侧主通道入口，7右侧主通道入口，8半球形界面。图3本专利技术肾小球芯片半球界面接种肾小球微组织放大图；图4肾小球滤过功能表征；图5不同浓度的醋酸镉的肾毒性评价a肾小球的Live/Dead染色图b肾小球CCK-8活力定量结果；c醋酸镉对肾小球LDH漏出的影响。图6不同浓度的醋酸镉对肾小球滤过功能的影响aIgg在肾小球的渗透性；b白蛋白在肾小球的渗透定量结果。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1肾小球芯片的构建及功能表征一种微流控芯片，如图2所示：该微流控芯片由左侧主通道1、右侧主通道4、胶原通道3、胶原通道入口5、左侧主通道入口6以及右侧主通道入口7组成，胶原通道3左连左侧主通道1，右连右侧主通道4。所述左侧主通道1为I形，所述芯片的右侧主通道4为U型，所述胶原通道3为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧主通道1和右侧主通道4相连接，横向结构的数量为3个；胶原通道3与左侧主通道1的交界为半球形界面，胶原侧为凹面。所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道1、右侧主通道4高度为300μm，胶原通道3高度为100μm，主通道高度：胶原通道3高度为3:1。所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为具微结构的可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃或不具结构的可透光透气的PDMS聚合物。设计并制作微流控芯片，流程如图1所示。SU8胶甩100μm厚，曝光胶原通道结构。在其上再甩200μm厚SU8胶，对齐后曝光主通道结构，显影制成模板，浇PDMS制成芯片，打孔备用。PDMS芯片等离子封接1小时后，配制浓度为4mg/mL的胶原工作液，将胶原灌注到芯片孵育30min后，从细胞入口池加入肾小球微组织细胞悬液，竖立芯片10min，使细胞贴附在胶原一侧，如图3所示。可见，肾小球微组织在界面形成一屏障层。侧立培养过夜，后可放平培养。在左侧主通道分别加入荧光素钠(绿色荧光)、Igg(红色荧光)，荧光显微镜下于0min、15min、30min、60本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片由左侧主通道(1)、右侧主通道(4)、胶原通道(3)、胶原通道入口(5)、左侧主通道入口(6)以及右侧主通道入口(7)组成，胶原通道(3)左连左侧主通道(1)，右连右侧主通道(4)。

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片由左侧主通道(1)、右侧主通道(4)、胶原通道(3)、胶原通道入口(5)、左侧主通道入口(6)以及右侧主通道入口(7)组成，胶原通道(3)左连左侧主通道(1)，右连右侧主通道(4)。2.按照权利要求1所述的一种基于微流控芯片，其特征在于左侧主通道(1)为I形或U形，所述芯片的右侧主通道(4)为U型，所述胶原通道(3)为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧主通道(1)和右侧主通道(4)相连接，横向结构的数量为1～10个；胶原通道(3)与左侧主通道(1)的交界为半球形界面，胶原侧为凹面。3.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为具微结构的可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃或不具结构的可透光透气的PDMS聚合物。4.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道(1)、右侧主通道(4)高度为200～500μm，胶原通道(3)高度为80～200μm，主通道高度：胶原通道(3)高度为1～3:1。5.一种基于微流控芯片的的肾小球体系，其特征在于：采用上述微流控芯片，该肾小球体系按以下步骤构建：(1)芯片预处理设计制作芯片，用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道，室温30min固化，将培养基引入主通道；(2)肾小球...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，李中玉，陶婷婷，郭雅琼，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21