幽门螺旋杆菌脂多糖外核心八糖的制备方法技术

本发明专利技术公开了幽门螺旋杆菌脂多糖外核心八糖的制备方法，属于糖化学领域。幽门螺旋杆菌外核心八糖的结构为(α‑D‑Glc‑(1‑3)‑α‑D‑Glc‑(1‑4)‑β‑D‑Gal‑(1‑7)‑D‑α‑D‑Hep[α‑D‑Glc‑(1‑6)‑α‑D‑Glc‑(1‑6)‑α‑D‑Glc‑(1‑2)‑D‑α‑D‑Hep]‑Linker。该结构由葡萄糖、半乳糖、七庚糖三种单糖构成。其中含有5个葡萄糖α糖苷键，1个半乳糖β糖苷键和两个七庚糖α糖苷键。本发明专利技术利用远程邻参与效应，溶剂效应，温度效应，添加剂以及离去基团的协同作用制备了该八糖。八糖的还原端还可接有连接臂用于将来与蛋白质连接制成糖缀合物，用于免疫学研究。

Preparation of Helicobacter pylori lipopolysaccharide outer core eight sugar

The invention discloses a preparation method of Helicobacter pylori lipopolysaccharide outer core eight sugar, belonging to the field of sugar chemistry. The structure of the eight sugars outside the outer core of Helicobacter pylori is (alpha D Glc, 1, 4), Glc, D, Gal, D, D, D, Hep[, D, D, Hep[, Glc D (1, 6). The structure consists of three monosaccharides, glucose, galactose and seven heptanose. It contains 5 glucose alpha glucoside bonds, 1 galactose beta glycoside bonds and two seven heptanose alpha glucoside bonds. The eight sugar is prepared by remote neighbor participation, solvent effect, temperature effect, additive and synergistic action of leaving group. Eight the reductive end of the sugar can also be connected with a connecting arm for making glycoconjugates in the future to be used for immunological research.

【技术实现步骤摘要】
幽门螺旋杆菌脂多糖外核心八糖的制备方法
本专利技术涉及幽门螺旋杆菌脂多糖外核心八糖的制备方法，属于糖化学领域。
技术介绍
幽门螺旋杆菌(HelicobacterPylori,H.P.)在1994年被世界卫生组织列为I类致癌因子，它是一种革兰氏阴性菌，栖息在上皮细胞表面，被胃粘膜表面的粘液覆盖。世界上超过50％的人口上消化道感染了幽门螺旋杆菌，在发展中国家高达70％感染人群，在发达国家也达到20％～30％。急性感染中20％的病人发展为溃疡，1％的感染着甚至可能发展为胃癌或者粘膜相关淋巴瘤。2005年诺贝尔生理或医学奖授予澳大利亚两位科学家Warren和Mashall以表彰他们对于发现幽门螺旋杆菌在引发消化道疾病以及胃癌中的重要作用。目前最普遍的治疗幽门螺旋杆菌的方法是“三联疗法”，它主要利用质子泵抑制剂以及两种抗生素对幽门螺旋杆菌进行清除。但是用药后患者容易复发，且常常出现恶心、腹泻、假膜性肠炎等不良反应。伴随着抗生素的频繁使用，抗抗生素的幽门螺旋杆菌的菌株不断被发现，这也使得抗生素治疗幽门螺旋杆菌的效率逐渐降低。所以对于幽门螺旋杆菌疫苗的开发一直都是科学家研究的热点。目前市场上还没有能防止幽门螺旋杆菌感染或者治疗幽门螺旋杆菌的疫苗存在。糖类疫苗作为疫苗开发的新的目标分子，越来越被科学家们重视，细菌表面的多糖结构往往对于细菌的致病性以及人体内免疫识别具有重要的作用，所以通过化学方法合成幽门螺旋杆菌表面寡多糖用于开发幽门螺旋杆菌疫苗具有非常重要的意义。幽门螺旋杆菌细胞表面的寡糖为脂多糖(Lipopolysacchardie,LPS)，它的LPS由O-抗原，核心结构，和脂质A三部分组成。幽门螺旋杆菌总共有6中血清型，O1-O6，它们的区别最主要是O-抗原糖部分的不同。不同血清型幽门螺旋杆菌的LPS的核心结构相对比较保守，所以通过化学合成其核心结构用作预防和治疗幽门螺旋杆菌感染的糖疫苗是非常好的一个选择。幽门螺旋杆菌核心结构包括内核心和外核心，外核心结构更容易暴露于环境，对于幽门螺旋杆菌感染引起体内的免疫反应有非常重要的作用。目前研究的幽门螺旋杆菌脂多糖核心结构主要利用生物法从灭活的细菌中提取，其缺陷在于通常一次提取得到的产物量少，提取的分子结构也不均一，实验重复性差。所以我们选取幽门螺旋杆菌外核心八糖为我们的目标分子进行化学全合成，通过化学合成，我们可以大量的得到分子均一、结构确定的目标结构。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是通过化学方法合成幽门螺旋杆菌外核心八糖，这个八糖结构中含有五个葡萄糖1，2-α糖苷键的合成是目标八糖的关键步骤。本专利技术利用远程邻基参与效应、溶剂效应、温度效应，添加剂和离去基团的协同作用，提高糖基化过程的α选择性。此协同作用成功的解决了葡萄糖α糖苷键的形成的难题。利用合成的葡萄糖糖砌块，半乳糖糖砌块，庚糖糖砌块，合成保护的最后的目标八糖，最后脱去保护得到目标八糖如式1。同时，八糖的还原端为带有氨基的连接臂，为以后连接蛋白制成糖缀合物疫苗做了准备。其中，R为-(CH2)n-N-Y1Y2或者-(CH2)n-N-Y1Y2(linker)，n＝1～10，Y1为H或者为卞基(Bn)，Y2为H或者卞甲氧羰基(Cbz)。R1，R2，R3，R6，R7，R8，R10，R12，R14，R15，R16，R18，R20，R21，R23，R24，R26为H或者苄基(Bn)；R5，R11，R17，R19，R22，R25为H或者2-萘甲基(Nap)；R4，R9，R13，R27为酯基。N为氮。本专利技术还提供式Ⅰ所示化合物的合成方法，具体包括以下步骤：步骤一，合成葡萄糖糖砌块A，糖砌块A的结构如式Ⅱ所示，其端基位为N-苯基-三氟乙酰亚胺酯，为离去基团；其余取代基Rn参见式Ⅰ。具体地，单糖砌块A的合成方法包括：以全乙酰化葡萄糖为起始原料，在路易斯酸的作用下与对甲苯硫酚作用生成全乙酰硫糖苷化合物，在碱性条件下脱去乙酰基，裸露四个羟基，所得四羟基化合物与苯甲醛二甲缩醛(PhCH(OCH3)2)在对甲苯磺酸(p-TsOHH2O)的催化下生成4，6-苄叉基保护的硫糖苷化合物；把4，6-苄叉基保护的硫糖苷化合物的3-OH用2-甲基萘(2-Nap)保护，2-OH用苄基(Bn)保护后得到全保护化合物，然后在硼烷(BH3THF)和路易斯酸的作用下选择性打开4，6-卞叉基，裸露6-OH，裸露的6-OH再用酰基保护，得到全保护的葡萄糖硫糖苷化合物，全保护的葡萄糖硫糖苷化合物在NBS或者NIS条件下水解，裸露端基位OH，端基位-OH与CF3CNPhCl反应，得到葡萄糖砌块A。步骤二，合成半乳糖糖砌块B，糖砌块B的结构如式Ⅲ所示，其端基位为叔丁基二丁基硅烷基(TBS)保护，其余取代基Rn参见式Ⅰ。具体地，单糖砌块B的合成方法包括：以化合物2，3-二-丙叉-6-卞基乙硫半乳糖为起始原料，2-OH用Bz保护，得到2-OBz化合物，2-OBz化合物在酸作用下打开丙叉基，得到2，3-二羟基化合物，2，3-二羟基化合物的3-OH选择性的用Bn保护得到3-OBn化合物，3-OBn化合物的4-OH用Lev保护，得到4-Lev硫糖苷化合物，4-Lev硫糖苷化合物在NBS条件下水解，裸露端基位OH，端基位-OH与叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)反应，得到端基TBS全保护的半乳糖，在醋酸肼作用下脱去Lev得到半乳糖砌块B。步骤三，合成庚糖砌块C、D，如式Ⅳ所示，糖砌块C端基位为乙硫基保护，R17为Nap保护；糖砌块D端基位为linker，例如O-(CH2)n-N(Bn)Cbz，或者O-(CH2)n-SBn，或者O-(CH2)n-N3；R17为酰基保护；其余取代基Rn参见式I。具体地，单糖砌块C，D的合成方法包括：以2，3-O-丙叉基-4-O-卞基甘露乙硫糖苷为起始原料，经过swern氧化，得到相应的醛，然后经过witting烯化延长6位的碳链，得到6位脱氧的烯烃化合物，烯烃化合物经过双羟基化得到6，7-二-羟基化合物，在7-OH上利用二丁基氧化锡(Bu2SnO)选择性的用Nap保护得到7-Nap化合物，6-OH用Bn保护得到全保护化合物；将全保护化合物在80％的醋酸作用下脱去丙叉基后得到2，3-二-羟基化合物，利用二丁基氧化锡(Bu2SnO)和Nap选择性的保护3-OH，得到庚糖砌块C；糖砌块C的2-OH用Lev保护后得到2-Lev化合物，2-Lev化合物与连接臂(linker)反应，得到端基位连接臂的庚糖化合物，7-Nap在DDQ的作用下离去得到7-OH化合物，7-OH化合物用乙酰基保护得到化合物7-OAc，最后在醋酸肼的作用下脱去Lev得到庚糖砌块D。步骤四，组装三糖供体：利用糖砌块合成三糖砌块G(式Ⅴ)，糖基化反应的条件反应溶剂为Et2O/DCM，加入相当于供体10当量的噻酚，使用分子筛为干燥剂，反应温度为0℃，反应时间为3～5h，反应过程都为氩气保护。反应用TLC板监控，当反应结束后用吡啶(Pyridine)淬灭反应，产物用硅胶柱纯化。三糖G端基位为N-苯基-三氟乙酰亚胺酯为离去基团，在八糖组装中作为糖基供体。(取代基Rn参见式Ⅰ)步骤五，组装五糖受体：利用糖砌块合成五糖砌块H(式Ⅵ)，氟糖苷糖基化反应的条件：溶剂为Et2O/DCM，加入相当于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种幽门螺旋杆菌外核心八糖或其衍生物，其特征在于，如式Ⅰ所示：

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺旋杆菌外核心八糖或其衍生物，其特征在于，如式Ⅰ所示：其中，R为-(CH2)n-N-Y1Y2或者-(CH2)n-N-Y1Y2(linker)，n＝1～10，N为氮，Y1为H或者为卞基(Bn)，Y2为H或者卞甲氧羰基(Cbz)；R1，R2，R3，R6，R7，R8，R10，R12，R14，R15，R16，R18，R20，R21，R23，R24，R26为H或者苄基(Bn)；R5，R11，R17，R19，R22，R25为H或者2-萘甲基(Nap)；R4，R9，R13，R27为者酯基。2.合成权利要求Ⅰ所述幽门螺旋杆菌外核心八糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，合成需要的单糖砌块A，B，C，D：其中，Rn如权利要求Ⅰ所述但不为H；步骤二，通过糖基化反应组装保护八糖；步骤三，八糖的脱保护。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中，合成单糖砌块A，B，C，D时，所用的溶剂为干燥二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、吡啶、氯仿、80％醋酸水溶液中的一种或者几种；底物浓度为0.02～0.5M；作为反应试剂或催化剂的酸为盐酸、乙酸或对甲苯磺酸；反应温度为-78℃～溶剂的回流温度；反应时间为1～48h。4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤二包括(1)三糖供体的组装、(2)五糖受体的组装、(3)全保护八糖的组装；其中，三糖供体的组装条件为：底物为糖砌块A、B，反应溶剂为Et2O/DCM，加入相对于供体10当量的噻吩，使用干燥剂，反应温度为0℃～室温，反应过程都为惰性气体保护，反应原料消失后，用吡啶或者三乙胺淬灭反应，过滤，洗涤，萃取，干燥，产物用硅胶柱纯化；五糖受体的组装条件为：底物为糖砌块A，C，D，反应溶剂为反应溶剂为Et2O/DCM或者DCM，加入相对于供体10当量的噻吩，使用干燥剂，反应温度为0℃～室温，反应过程都为惰性气体保护，反应原料消失后，用吡啶或者三乙胺淬灭反应，过滤，洗涤，萃取，干燥，产物用硅胶柱纯化；八糖的组装条件为：底物为上述三糖供体...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹健，胡静，彼特·泽贝格，邹小鹏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32