截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法与编码基因技术

本发明专利技术提供了一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。本发明专利技术还提供了制备融合蛋白的方法，包括：制备质粒、转化、多拷贝插入重组子的筛选、发酵和纯化。本发明专利技术还提供了融合蛋白的编码基因，包含该编码基因的表达载体、细胞系。

Fusion protein of truncated human rat's signal protein and penetrating peptide, preparation method and coding gene thereof

The present invention provides a fusion protein of a truncated human mouse signal protein and a membrane peptide, including a truncated human mouse signal protein sequence and a membrane peptide sequence, in which the sequence of the truncated human mouse signal protein and the sequence of the membrane peptide are connected by a connective peptide. The invention also provides a method for preparing the fusion protein, comprising: preparation of plasmid, transformation, screening, fermentation and purification of multiple copy insertion recombinants. The invention also provides a coding gene of the fusion protein, including the expression vector and cell line of the coding gene.

【技术实现步骤摘要】
截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法与编码基因
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法，本专利技术还涉及所述融合蛋白的编码基因。
技术介绍
刺鼠信号蛋白(Agoutisignalingprotein,ASIP)由Agouti基因编码,不同物种的Agouti基因及刺鼠信号蛋白有较高的同源性。Agouti基因编码的刺鼠信号蛋白由131个氨基酸构成，包含N端22个氨基酸残基的信号肽和109个氨基酸残基的功能区。1994年Lu等发现刺鼠相关蛋白(ASIP)与黑皮素受体(MCR)有高度的亲和力，ASIP与α-促黑素(MSH)竞争性和黑皮素受体-1(MC1R)结合，阻滞α-MSH下游的信号传导进而抑制黑素合成。体外黑素细胞培养实验也证实，加入ASIP可拮抗α-MSH，抑制黑素细胞内的cAMP水平升高、抑制酪氨酸酶TRP-1和TRP-2的表达，使黑素细胞合成黑素降低。也有实验表明ASIP在自体移植皮片中能竞争性拮抗α-MSH的黑素合成，使皮片着色能力降低，从而证明皮片移植后表皮细胞中α-MSH的表达上调是皮片呈过度色素沉着的重要原因。从而可以得出结论，ASIP对皮肤颜色的影响主要是通过抑制黑素的合成实现的。刺鼠信号蛋白具有显著的抑制黑色素生成的活性，在皮肤色素沉着中具有很好的应用潜力，但目前还未见到重组刺鼠信号蛋白表达及应用的报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法与编码基因。一方面，本专利技术提供了一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。另一方面，本专利技术提供了前述融合蛋白的制备方法，包括：(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQIDNo:4的核苷酸序列，对pPIC9K载体及SEQIDNo:4的核苷酸序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；(2)转化：将步骤(1)制备的质粒转化毕赤酵母感受态细胞，获得转化后菌落；(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步筛选，获得转化子；(4)发酵：对步骤(3)获得的转化子进行发酵培养获得发酵液；(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。另一方面，本专利技术提供了前述融合蛋白的编码基因。另一方面，本专利技术提供了含有前述编码基因的表达载体。另一方面，本专利技术提供了含有前述编码基因的细胞系。另一方面，本专利技术提供了前述融合蛋白在制备药品中的应用。另一方面，本专利技术提供了前述融合蛋白在制备化妆品中的应用。本专利技术的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白中的截短型人刺鼠信号蛋白是对天然刺鼠信号蛋白的剪切，选取C端的50个氨基酸，但其仍具有抑制黑色素生成活性；同时在截短型刺鼠信号蛋白的N端添加了细胞穿膜肽，以便于在色素沉着皮肤中的应用时透过皮肤屏障。附图说明图1是实施例1中pPIC9K-YARA-ASIP50质粒图谱。图2是实施例1中截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白发酵液纯化前后电泳图。图3是实施例3中进行的体内抑制酪氨酸酶活性测定结果柱形图。具体实施方式为了充分说明本专利技术解决技术问题所实施使用的技术方案。下面结合实施例和附图对专利技术做详细说明，但本专利技术的技术方案、技术方案的实施方式以及保护范围并不仅仅限于此。除非另有说明，否则下文中出现的科技和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。刺鼠信号蛋白具有显著的抑制黑色素生成的活性，在皮肤色素沉着中具有很好的应用潜力，但目前还未见到重组刺鼠信号蛋白表达及应用的报道。本专利技术的专利技术人分析了人刺鼠信号蛋白功能区序列，去除人刺鼠信号蛋白功能区109个氨基酸N端部分不利于在表达的区域(富含Kex2酶切位点)，保留C端50个氨基酸残基，并与细胞穿膜肽融合，实现了在毕赤酵母中表达，作为一种抑制黑色素合成原料，可应用于药品和化妆品。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。其中，截短型人刺鼠信号蛋白序列是人刺鼠信号蛋白C端50个氨基酸的序列或者与其具有至少85％同源性，优选至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。其中，所述人刺鼠信号蛋白C端50个氨基酸的序列是序列表中SEQIDNo:1的氨基酸序列。专利技术人通过研究发现，保留人刺鼠信号蛋白序列C端50个氨基酸残基，既去除了人刺鼠信号蛋白序列上不利于表达的区域，又能够有利于融合蛋白的穿膜。其中，穿膜肽是一类能够携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖于经典的胞吞作用。在本专利技术中，穿膜肽序列是序列表中SEQIDNo:2的氨基酸序列，或者，与SEQIDNo:2具有至少85％同源性，优选至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。其中，连接肽是由甘氨酸和丝氨酸组成的序列；常用的连接肽均可用于本专利技术中，例如GGGS。在一种优选的具体实施方式中，本专利技术的融合蛋白是序列表中SEQIDNo:3的氨基酸序列。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了前述的融合蛋白的制备方法，包括：(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQIDNo:4的核苷酸序列，对pPIC9K载体及SEQIDNo:4的核苷酸序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；(2)转化：将步骤(1)制备的质粒转化毕赤酵母感受态细胞，获得转化后菌落；(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步筛选，获得转化子；(4)发酵：对步骤(3)获得的转化子进行发酵培养获得发酵液；(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。优选地，步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液进行微滤，收集滤液，再进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后进行离子交换层析，即可得到产品。在一种优选的具体实施方式中，本专利技术的融合蛋白的制备方法，包括：(1)制备质粒人工全基因合成序列表中的SEQIDNo:4的核苷酸序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQIDNo:4的核苷酸序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-YARA-ASIP50；(2)毕赤酵母电转化将经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-YARA-ASIP50质粒，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养3～4天，在MD培养基平板上长出菌落；(3)多拷贝插入重组子的筛选将MD培养基平板上长出的菌落对应接种到G418浓度分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；(4)发酵将筛选到的转化子接种于BMGY培养基中，振荡培养24小时，作为一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，其特征在于，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。

【技术特征摘要】
1.一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，其特征在于，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述截短型人刺鼠信号蛋白序列是人刺鼠信号蛋白C端50个氨基酸的序列或者与其具有至少85％同源性，优选至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列；其中所述人刺鼠信号蛋白C端50个氨基酸的序列是序列表中SEQIDNo:1的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述穿膜肽序列是序列表中SEQIDNo:2的氨基酸序列，或者，与SEQIDNo:2具有至少85％同源性，优选至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽是由甘氨酸和丝氨酸组成的序列。5.根据权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是序列表中SEQIDNo:3的氨基酸序列。6.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQIDNo:4的核苷酸序列，对pPIC9K载体及SEQIDNo:4的核苷酸序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；(2)转化：将步骤(1)制备的质粒转化毕赤酵母感受态细胞，获得转化后菌落；(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步筛选，获得转化子；(4)发酵：对步骤(3)获得的转化子进行发酵培养获得发酵液；(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液进行微滤，收集滤液，再进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后进行离子交换层析，即可得到产品。8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，包括：(1)制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯增淼，李晓颖，李敏，高恩，杨小琳，赵金礼，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61