人源抗人CD47抗体及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术提供一种人源抗人CD47抗体及其编码基因与应用。本发明专利技术通过抗体库技术和基因工程手段，从全合成人抗体库中筛选出抗人CD47单链抗体，获得其可变区基因，并构建IgG形式的人单克隆抗体重组载体，表达、纯化获得高纯度抗体蛋白。本发明专利技术抗体与人CD47亲和力KD不大于10nM，其突变体亲和力KD不大于50nM；本发明专利技术抗体能有效阻断CD47与SIRPα的结合，促进免疫细胞对肿瘤细胞的吞噬，对CD47表达阳性的白血病模型小鼠具有明确的治疗作用，与EGFR等靶向药物联用具有明显协同作用。本发明专利技术为针对CD47靶标的抗肿瘤及其他相关疾病如动脉粥样硬化、炎症的预防和治疗提供了特异性抗体药物。

Human anti human CD47 antibody and its coding gene and Application

The invention provides a human anti human CD47 antibody and its coding gene and application. In this invention, the anti human CD47 single chain antibody was screened from antibody library and gene engineering, and its variable region gene was obtained. The recombinant vector of human monoclonal antibody in the form of IgG was constructed, and the high purity antibody protein was obtained by expression and purification. The affinity KD of the invention and human CD47 is not more than 10nM, and its mutant affinity KD is not more than 50nM; the antibody can effectively block the combination of CD47 and SIRP alpha and promote the phagocytosis of immune cells to tumor cells. It has a definite therapeutic effect on the leukemia model mice with positive CD47 expression, and is combined with the target drugs such as EGFR and other drugs. Obvious synergy. The invention provides a specific antibody drug for the prevention and treatment of CD47 target's anti-tumor and other related diseases, such as atherosclerosis and inflammation.

【技术实现步骤摘要】
人源抗人CD47抗体及其编码基因与应用
本专利技术涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，主要是涉及特异性针对人CD47的抗体及其编码基因与应用。
技术介绍
CD47又称整联蛋白(integrin—associatedprotein，IAP)、OV-3(卵巢癌标志物)、或MER6，其全长305个氨基酸，胞外氨基端为一个IgV样的胞外结构域，高度疏水延伸的5个跨膜片段和1个短的选择性拼接的羧基端胞质尾区，其中IgV样结构域是其主要配体结合部位。其配体包括：信号调节蛋白α链(Signal-regulatoryproteinα，SIRPα)、凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin，TSP)和整合素(Integrins)。CD47广泛表达于细胞膜表面，存在于所有组织的不同细胞上，尤其是白细胞，如多形核白细胞(PMN)、树突状细胞(DC)、T细胞，红细胞，胎盘，血小板，正常造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSCs)等正常细胞。同时，CD47在人体大部分肿瘤细胞中高表达，并且它可以作为肿瘤诊断及判断预后的一个标准。如在急慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肾癌、多发性骨髓瘤等多种实体肿瘤细胞或肿瘤干细胞(如白血病干细胞leukemiastemcells，LSC)存在过表达，并且其高表达与临床预后差相关。研究表明，肿瘤细胞表面的CD47通过与巨噬细胞、DC细胞等免疫细胞表面的SIRPα配体结合，向其传递―don’teatme”的抑制信号，从而逃避这些细胞的吞噬(KershawMHandSmythHJ.Science.2013,vol341:41-42)，并进而逃避吞噬后肿瘤抗原的递呈所导致的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用(VonderheideRH,NatureMedicine,2015,21,1122–1123)。研究表明(ChaoMP.Curr.Opin.Immunol.2012,24(2):225–32；LiuXJ,Naturemedicine,2015,21(10),1209-15)，通过阻断肿瘤细胞表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRPα的相互作用，可以促进巨噬细胞、DC细胞对肿瘤细胞的吞噬，并进一步增加肿瘤抗原的提呈，激活获得性免疫应答。抗CD47抗体或抗SIRPα抗体同样能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。其次，抗CD47单抗也可通过Fc受体介导的细胞毒作用清除肿瘤细胞；另外，抗CD47单抗还可能通过直接诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞。目前，已经有多个抗CD47治疗性抗体进入临床研究阶段(NCT02096770，NCT02216409，NCT02367196，NCT02447354，NCT02488811)。此外，研究表明，阻断CD47与SIRPα的结合，还可以防治动脉粥样硬化(KojimaY,VolkmerJP,McKennaK,etal.Nature,2016,536:86-90)，提示抗CD47抗体可能在心血管疾病的治疗中也有良好的应用前景。人源抗体是治疗性抗体发展的最终方向，临床上应用人抗体，患者依从性好，可最大限度减少抗体的免疫原性、延长药物在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理、ADCC及CDC等效应，进而增强抗体的生物学效应。抗体库技术是获得人抗体的重要技术手段，其具有简单、便捷和灵活等特点，目前已经有多个来自于抗体库技术的抗体上市或处于临床研究阶段。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供人源抗人CD47抗体及其活性片段的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的编码基因。本专利技术的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在治疗或预防表达人CD47阳性的恶性肿瘤和其他相关疾病中的应用。本专利技术运用噬菌体表面展示技术，从大容量全合成人源单链抗体库中，通过多轮的生物淘洗(bio-panning)，筛选获得特异性抗人CD47的单链基因工程抗体(singlechainvariablefragment,scFv)。并将上述抗体轻、重链可变区基因分别克隆入人源全抗体哺乳动物细胞瞬时表达载体pABL和pABG1中，通过共转染HEK293T细胞进行瞬时分泌表达，得到人源抗体ZF1的全抗体，ZF1轻链可变区氨基酸序列特征如下：LCDR1为SGDALGDKYAS(SEQIDNO.1)，LCDR2为EDSKRPS(SEQIDNO.2)，LCDR3为QLRAGNAAGW(SEQIDNO.3)；重链可变区氨基酸序列如下：HCDR1为SYAMS(SEQIDNO.4)，HCDR2为AISGSGGSTYYADSVKG(SEQIDNO.5)，HCDR3为TWWRLFDY(SEQIDNO.6)，ZF1轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。本专利技术还利用酵母展示抗体库技术，构建针对单链抗体ZF1重链CDR2区的酵母展示突变库并进行筛选，最终获得突变体抗体的轻重链可变区基因，并将其轻、重链可变区基因分别克隆入人源全抗体哺乳动物细胞瞬时表达载体pABL和pABG1中，通过共转染HEK293T细胞进行瞬时分泌表达、纯化，得到突变体抗体的全抗体纯品。本专利技术提供的抗体可变区氨基酸序列模式为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在此，FR1～4代表4个框架区域，CDR1～3代表3个高变区。其中，重链为人免疫球蛋白胚系基因VHIII家族，轻链为LambdaIII家族，进一步地，轻链框架序列(FR1～4)如SEQIDNO.38-41所示，重链框架氨基酸序列(FR1～4)如SEQIDNO.42-45所示。关于轻重链的CDR区，通过丙氨酸扫描及其他同类氨基酸突变，获得大量突变体，对轻链CDR1、CDR2和CDR3的突变体评价结果表明(此处涉及大量突变位点信息，当一个位置为突变位点时，其他位点氨基酸序列保持不变)：LCDR1序列：S1G1D1A1LG2D2KYA2S2(SEQIDNO.1)，其中，S1可以替换为Ala；G1可以替换为Ser或Ala；D1可以替换为Ala；A1可以替换为Asn、Gly或Lys；L可以替换为Ala；G2可以替换为Ala；D2可以替换为Met、Leu、Glu、Lys或Trp；Y可以替换为Ala或Gln；A2可以替换为Ser或Gly；S2可以替换为Ala。LCDR2序列：EDS1KRPS2(SEQIDNO.2)，在此，S1可以替换为Val、Gly或Ala；K可以替换为Ala；R可以替换为Val、Ser或Ala。且S1和R可同时替换为Val。LCDR3序列：QLRA1G1NA2A3G2W(SEQIDNO.3)，其中，L可以替换为Val；G1可以替换为Ser或Ala；N可以替换为Asp、Ala、Ser、Tyr、The、Pro、Glu、Phe、Ile、Trp、Val或Leu，优选为Tyr；A2可以替换为Ser、The、Pro、Asp、Lys、Ile或Gly，优选为Pro；G2可以替换为Ala。且当N替换为Tyr和The时，A2可同时替换为Pro、The和Lys。对重链CDR1、CDR2和CDR3的突变体评价结果表明：HCDR1序列：S1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源抗人CD47抗体，其特征在于，其为：(1)其轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；或(2)其轻链可变区中，SEQ ID NO.1所示的LCDR1的第1‑7、9‑11位的任一位氨基酸突变，LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；或(3)其轻链可变区中，SEQ ID NO.2所示的LCDR2的第3、4、5位的任一位或多位氨基酸突变，LCDR1、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；或(4)其轻链可变区中，SEQ ID NO.3所示的LCDR3的第2、5‑7、9位的任一位或多位氨基酸突变，LCDR1、LCDR2、HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；或(5)其重链可变区中，SEQ ID NO.4所示的HCDR1的第1、2、4位的任一位氨基酸突变，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；或(6)其重链可变区中，SEQ ID NO.5所示的HCDR2的第1‑9、11‑17位的任一位氨基酸突变，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1和HCDR3分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；或(7)其重链可变区中，SEQ ID NO.6所示的HCDR3的第3位氨基酸突变，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1和HCDR2分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；或(8)其轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其重链可变区HCDR1和HCDR3分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示，HCDR2如SEQ ID NO.9‑33任一所示。...

【技术特征摘要】
2016.10.18 CN 20161090827881.一种人源抗人CD47抗体，其特征在于，其为：(1)其轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，其重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；或(2)其轻链可变区中，SEQIDNO.1所示的LCDR1的第1-7、9-11位的任一位氨基酸突变，LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；或(3)其轻链可变区中，SEQIDNO.2所示的LCDR2的第3、4、5位的任一位或多位氨基酸突变，LCDR1、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；或(4)其轻链可变区中，SEQIDNO.3所示的LCDR3的第2、5-7、9位的任一位或多位氨基酸突变，LCDR1、LCDR2、HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；或(5)其重链可变区中，SEQIDNO.4所示的HCDR1的第1、2、4位的任一位氨基酸突变，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；或(6)其重链可变区中，SEQIDNO.5所示的HCDR2的第1-9、11-17位的任一位氨基酸突变，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1和HCDR3分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.6所示；或(7)其重链可变区中，SEQIDNO.6所示的HCDR3的第3位氨基酸突变，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1和HCDR2分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示；或(8)其轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，其重链可变区HCDR1和HCDR3分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.6所示，HCDR2如SEQIDNO.9-33任一所示。2.如权利要求1所述的人源抗人CD47抗体，其特征在于，(2)中所述SEQIDNO.1所示的LCDR1的第1-7、9-11位的任一位氨基酸突变是指以下位点的任一种突变，且所述突变均为单点突变：第1位的Ser替换为Ala；或第2位的Gly替换为Ser或Ala；或第3位的Asp替换为Ala；或第4位的Ala替换为Asn、Gly或Lys；或第5位的Leu替换为Ala；或第6位的Gly替换为Ala；或第7位的Asp替换为Met、Leu、Glu、Lys或Trp；或第9位的Tyr替换为Ala或Gln；或第10位的Ala替换为Ser或Gly；或第11位的Ser替换为Ala。3.如权利要求1所述的人源抗人CD47抗体，其特征在于，(3)中所述SEQIDNO.2所示的LCDR2的第3、4、5位的任一位或多位氨基酸突变是指：第3位的Ser替换为Val、Gly或Ala；或第4位的Lys替换为Ala；或第5位的Arg替换为Val、Ser或Ala；或第3位的Ser和第5位的Arg同时替换为Val。4.如权利要求1所述的人源抗人CD47抗体，其特征在于，(4)中所述SEQIDNO.3所示的LCD...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙志伟，王双，曾大地，范铁炯，闫凯境，韩进，张畅，范蒋锋，杨晓鹏，徐磊，常红艳，仇玮祎，杜鹏，孙九如，朱孔黎，
申请(专利权)人：上海赛远生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31