一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽制造技术

本发明专利技术公开了一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，氨基酸序列为Asp‑Gln‑Leu‑Thr‑Lys（DQLTK）。制备方法为：以厚壳贻贝粉末为原料，通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解，乙醇醇沉，再经Sephadex G‑15凝胶色谱柱层析纯化和高效液相色谱分离纯化得到。有益效果为：本发明专利技术提供的一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，通过影响小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性，抑制食物和胆固醇在小肠刷状缘的吸收，减少肠道胆固醇向肝脏转运，从而减少肝脏细胞胆固醇的含量。经检测，上述调脂五肽可明显降低细胞中总胆固醇（TC）含量和甘油三脂（TG）含量。

A kind of thick shell mussel Mytilus oculi enzyme demodulated lipid five peptide

The invention discloses a thick shell mussel shell enzyme enzyme demodulating fat five peptide, and the amino acid sequence is Asp Gln Leu Leu Thr Lys. The preparation method is: using mussel powder with thick shell as raw material, enzymatic hydrolysis by papain and trypsin, ethanol alcohol precipitation, and purification by Sephadex G 15 gel chromatography column chromatography and high performance liquid chromatography separation and purification. The beneficial effect is as follows: the present invention provides a thick shell Mytilus mussels enzyme to demodulate fat five peptide, which can inhibit the absorption of food and cholesterol in the brush edge of the small intestine, reduce the transport of cholesterol to the liver, and reduce the cholesterol content of liver cells by affecting the activity of the carrier and transport of the carrier of the cholesterol microcolloid in the small intestine brush edge. . After testing, the above five peptides can significantly reduce the total cholesterol (TC) content and glycerol three lipid (TG) content in the cells.

【技术实现步骤摘要】
一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽
本专利技术涉及生物活性肽
，具体是一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽。
技术介绍
厚壳贻贝（Myliuscoruscus）又称海红，是贻贝目壳菜蛤属中的一种，主要分布于黄、渤海和东海沿岸，浙江省自然资源丰富，尤其在舟山（舟山嵊泗有“贻贝之乡”之称）。高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。由于脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常称为高脂血症，脂质不溶或微溶于水必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，因此，高脂血症常为高脂蛋白血症（hyperlipoproteinemia），表现为高胆固醇血症、高甘油三酯血症等。高脂血症在中老年人群中发病率高，而且和其他疾病如高血压，糖尿病及动脉粥样硬化的成因关系紧密，对血脂的调节，有助于治疗心血管系统疾病。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，氨基酸序列为Asp-Gln-Leu-Thr-Lys，体外活性显示具有较好的调节脂质代谢的活性。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，氨基酸序列为Asp-Gln-Leu-Thr-Lys（DQLTK）。上述调脂五肽通过影响小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性，抑制食物和胆固醇在小肠刷状缘的吸收，减少肠道胆固醇向肝脏转运，从而减少肝脏细胞胆固醇的含量。但调脂五肽对小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性的具体影响机理尚不明确。经检测，上述调脂五肽可明显降低细胞中总胆固醇（TC）含量和甘油三脂（TG）含量。调脂五肽以厚壳贻贝粉末为原料，通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解，乙醇醇沉，再经SephadexG-15凝胶色谱柱层析纯化和高效液相色谱分离纯化得到。厚壳贻贝粉末与蒸馏水的质量体积比为1g：15~25mL，两者充分搅拌得到酶解底物；搅拌过程中温度条件为50~70℃恒温，搅拌时间为1.5~2.5h；酶解结束后均采用沸水浴灭酶。充分搅拌使得厚壳贻贝粉末均匀分布在蒸馏水中，形成的酶解底物适合木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的分步酶解。木瓜蛋白酶的加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.3~0.5倍，酶解pH为6.5~7.5，酶解时间为2.0~3.5h；胰蛋白酶加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.07~0.15倍，酶解pH为9.5~10.5，酶解时间为2.0~4.0h；胰蛋白酶酶解结束后溶液pH调至中性，酶解液浓缩至原体积的1/25~1/15。采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解方式将厚壳贻贝粉末中的蛋白质酶解成分子量小的活性物质。木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件不同，采用分步酶解的方式使得两种蛋白酶的酶解效率均处于较高状态。乙醇醇沉操作为在酶解浓缩液中加入3~6倍体积的85~95%乙醇，搅拌后静置，离心取沉淀，得到的沉淀即为调脂五肽粗品。调脂五肽属于活性短肽，不溶于乙醇，采用乙醇醇沉的方式将调脂五肽从混合溶液中分离出来，对产品进行初步纯化。醇沉得到的调脂五肽空间结构未受破坏，仍具有较好的生物活性。SephadexG-15凝胶色谱柱层析纯化操作为：用蒸馏水将SephadexG-15凝胶溶胀后装柱，检查柱均匀性后上样，用自动取样器收集洗脱液，在280nm下测紫外吸光度，做曲线；重复上样，根据吸光度曲线收集分离的溶液；上样溶液由质量体积比为1g：3~7mL的调脂五肽粗品和蒸馏水混合而成。先采用SephadexG-15凝胶色谱柱层析纯化调脂五肽粗品，减少后续高效液相色谱分离纯化的时间成本、原料成本和人工成本。高效液相色谱分离纯化条件为：色谱柱：反相C18键合硅胶柱；流动相：0~4min，水；4~16min，60~80%水，20~40%乙腈；16~35min，乙腈；流速：0.7~1.3ml/min，柱温25~35℃，检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到调脂五肽纯品。厚壳贻贝粉末为厚壳贻贝闭壳肌脱脂干燥得到。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术提供的一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，氨基酸序列为Asp-Gln-Leu-Thr-Lys（DQLTK）。上述调脂五肽通过影响小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性，抑制食物和胆固醇在小肠刷状缘的吸收，减少肠道胆固醇向肝脏转运，从而减少肝脏细胞胆固醇的含量。但调脂五肽对小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性的具体影响机理尚不明确。经检测，上述调脂五肽可明显降低细胞中总胆固醇（TC）含量和甘油三脂（TG）含量。附图说明图1为凝胶纯化图；图2为液相纯化图。具体实施方式下面通过附图和实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，氨基酸序列为Asp-Gln-Leu-Thr-Lys（DQLTK）。上述调脂五肽通过影响小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性，抑制食物和胆固醇在小肠刷状缘的吸收，减少肠道胆固醇向肝脏转运，从而减少肝脏细胞胆固醇的含量。但调脂五肽对小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性的具体影响机理尚不明确。经检测，上述调脂五肽可明显降低细胞中总胆固醇（TC）含量和甘油三脂（TG）含量。一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽的制备方法，包括以下步骤：1）厚壳贻贝粉末与蒸馏水按照质量体积比为1g：15~25mL混合，两者充分搅拌得到酶解底物；搅拌过程中温度条件为50~70℃恒温，搅拌时间为1.5~2.5h；2）在酶解底物中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.3~0.5倍，酶解pH为6.5~7.5，酶解时间为2.0~3.5h，酶解结束后沸水浴灭酶；加入胰蛋白酶，胰蛋白酶加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.07~0.15倍，酶解pH为9.5~10.5，酶解时间为2.0~4.0h；酶解结束后沸水浴灭酶，将溶液pH调至中性，酶解液浓缩至原体积的1/25~1/15；3）在酶解浓缩液中加入3~6倍体积的85~95%乙醇，搅拌后静置，离心取沉淀，得到的沉淀即为调脂五肽粗品；4）用蒸馏水将SephadexG-15凝胶溶胀后装柱，检查柱均匀性后上样，用自动取样器收集洗脱液，在280nm下测紫外吸光度，做曲线；重复上样，根据吸光度曲线收集分离的溶液；上样溶液由质量体积比为1g：3~7mL的调脂五肽粗品和蒸馏水混合而成；5）高效液相色谱分离纯化条件为：色谱柱：反相C18键合硅胶柱；流动相：0~4min，水；4~16min，60~80%水，20~40%乙腈；16~35min，乙腈；流速：0.7~1.3ml/min，柱温25~35℃，检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到调脂五肽纯品。厚壳贻贝粉末为厚壳贻贝闭壳肌脱脂干燥得到。实施例2：一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽的最优选制备方法，包括以下步骤：1）分步酶解：取25g厚壳贻贝粉末，加入500mL蒸馏水，在60℃水浴下磁力搅拌2h；调节pH至7，加入10g木瓜蛋白酶，酶解3h；在100℃的水浴中加热15min灭酶，在3500r/min下离心20min，去沉淀；调节pH至10，在60℃的恒温水浴中加热，加入2.5g胰蛋白酶，酶解3h；调节pH至中性后，100℃的水浴下加热灭酶15min；静置后3500r/min下离心35min，离心后取上清液，浓缩至原体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，其特征在于氨基酸序列为Asp‑Gln‑Leu‑Thr‑Lys（DQLTK）。

【技术特征摘要】
1.一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，其特征在于氨基酸序列为Asp-Gln-Leu-Thr-Lys（DQLTK）。2.根据权利要求1所述的一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，其特征在于：所述的调脂五肽以厚壳贻贝粉末为原料，通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解，乙醇醇沉，再经SephadexG-15凝胶色谱柱层析纯化和高效液相色谱分离纯化得到。3.根据权利要求2所述的一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，其特征在于：所述的厚壳贻贝粉末与蒸馏水的质量体积比为1g：15~25mL，两者充分搅拌得到酶解底物；搅拌过程中温度条件为50~70℃恒温，搅拌时间为1.5~2.5h；酶解结束后均采用沸水浴灭酶。4.根据权利要求2所述的一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，其特征在于：所述的木瓜蛋白酶的加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.3~0.5倍，酶解pH为6.5~7.5，酶解时间为2.0~3.5h；胰蛋白酶加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.07~0.15倍，酶解pH为9.5~10.5，酶解时间为2.0~4.0h；胰蛋白酶酶解结束后溶液pH调至中性，酶解液浓缩至原体积的1/25~1/15。5.根据权利要求2所述的一种厚壳贻...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈荫，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33