一种与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因制造技术

本发明专利技术公开了一种与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，本发明专利技术涉及立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因的功能及序列；通过转基因瞬时表达表明R1YBXS8是立枯丝核菌致病的多基因之一；该基因的发现对了解丝核菌致病的分子机制研究有一定的贡献。

An effector R1YBXS8 related to pathogenicity of Rhizoctonia solani and its coding genes

The invention discloses an effector R1YBXS8 and its encoding gene related to the pathogenesis of Rhizoctonia Rhizoctonia. The invention relates to the function and sequence of the effector of Rhizoctonia Rhizoctonia related effector R1YBXS8 and its encoding gene; through the transient expression of transgenic plants, R1YBXS8 is one of the multiple genes of the disease caused by Rhizoctonia Rhizoctonia; the discovery of the gene It has contributed to the understanding of the molecular mechanism of Rhizoctonia.

【技术实现步骤摘要】
一种与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因
本专利技术涉及一种与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，属于生物

技术介绍
真菌病原菌通过各种方式侵染植物，侵染是由真菌病原菌分泌的成百上千种效应蛋白调控的；真菌效应蛋白可在真菌菌丝与宿主之间的相互作用区域直接转移至植物体内而起作用；这些效应蛋白能抑制植物防御反应，调控植物生理机制使其能适应真菌侵染，并为真菌提供营养物质；丝核菌效应蛋白的研究较少，目前在立枯丝核菌中发现的只有一个同源于稻瘟病菌的Avr-Pita1基因，被称之为Rhiz-Pita基因。效应蛋白的研究采用的外源基因表达系统通常都是采用大肠杆菌的原核表达；但是由于目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低；所以采用原核表达所用时间较长，操作复杂且成功率较低；而以农杆菌(Agrobacterium)中的Ti质粒为载体进行基因转移具有操作简便的特点,但一直以来,这一转移体系只适用于双子叶植物,单子叶植物成功的例子较少,随着科学的发展，最近几年有越来越多的报道表明在单子叶植物上取得了很大的成功。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提出了一种与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，提供立枯丝核菌中一个与致病相关的效应子。本专利技术提供立枯丝核菌中一个与致病相关的效应子，名称为R1YBXS8，来源于丝核菌属，是如下1)或2)所示的蛋白质：1)由序列表1所示的氨基酸酸序列组成的蛋白质；2)由序列表1所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有转录激活功能的调控丝核菌致病的蛋白质。编码立枯丝核菌中与致病相关的效应子R1YBXS8的基因(R1YBXS8)，所示基因的核苷酸序列如下1)、2)或3)所示：1)序列表2中的DNA序列；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA序列；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA序列。含有本专利技术基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增R1YBXS8中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的另一个目的是提供一种致病植物中的致病性。本专利技术提供一种致病植物中的致病性的方法，是将所述的与致病相关的效应子的基因R1YBXS8导入植物组织或细胞，观察植物的症状。所述与丝核菌致病相关的效应子基因R1YBXS8可通过含有所述的与致病相关的效应子的基因R1YBXS8的植物表达载体导入外植体：用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任一种双元载体，如pBI101，pCAMBIA，pBIN19，pBI121等。以pBI121为出发载体，构建的含有所述与丝核菌致病相关效应子基因R1YBXS8的植物表达载体为pBI121-R1YBXS8。携带本专利技术R1YBXS8的植物表达载体可通过使用Ti质粒，农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，观察症状；被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，如水稻、玉米、小麦等，也可以是双子叶植物，如莴苣、白菜、辣椒、芹菜等。本专利技术与现有技术相比较，本专利技术的与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，通过转基因瞬时表达表明R1YBXS8是立枯丝核菌致病的多基因之一；该基因的发现对了解丝核菌致病的分子机制研究有一定的贡献。附图说明图1为基因与载体连接后pBI121-R1YBXS8的PCR验证图2为连接载体转入根癌农杆菌中后的LB培养基培养性状图3为含目的基因的农杆菌接种于莴苣叶片后的症状，B为对照。图4为含目的基因的农杆菌接种于水稻叶片后的症状，B为对照。具体实施方式实施例1、分泌蛋白基因导入双元载体pBI121：所用载体为pBI121，插入位点为XbaI/BamHI；(1)目的片段扩增：根据序列设计引物，通过PCR的方法扩增出足够量的目的产物；第一轮PCR反应采用的是pfu聚合酶；反应体系50ul：DNA1ul；引物MIX10ul；上下引物各1ul；dNTP1ul；10XpfuBuffer5ul；Pfu0.4ul，定容至50ul；PCR反应程序：第一步，反应温度为95℃，反应时间为3min；第二步，反应温度为94℃，反应时间为30s；第三步，反应温度为55℃，反应时间为30s；第四步，反应温度为72℃，反应时间为60s；第五步，反应温度为72℃，反应时间为6min；第二步到第四步循环22次；1)以第一轮PCR产物为模板，进行第二次扩增，目的是大量扩增；2)反应体系与反应步骤与第一次相同；3)在PCR结束之后，进行电泳回收目的片段；(2)PCR纯化产物与载体酶切；酶切目的基因体系为50ul；PCR纯化产物20ul；BamHI和XbaI各1ul；FDBuffer5ul，最后定容至50ul；酶切载体体系同样为50ul；pBI1211.5ug；BamHI和XbaI各1ul；FDBuffer10ul，最后定容至50ul；将上述酶切目的基因体系和酶切载体体系分别放入37℃恒温水浴锅中反应3h，电泳回收目的条带；(3)目的片段与载体连接：连接体系20ul；酶切目的片段6ul；酶切载体5ul；10XT4DNAligaseBuffer2ul；4DNAligase1ul，定容至20ul；将上述连接混合液置于16℃水浴2h；(4)转化，筛选克隆：将上述连接液转入DH5a中，检测筛选出阳性克隆进行测序；如图1所示，通过载体通用引物扩增验证连接成功：正向测序引物：GCAAGTGGATTGATGTGAT；反向测序引物：GCTTTCCCACCAACGCTGAT。实施例2、根癌农杆菌的培养转化：Cacl2冻融法分别转质粒进入EHA105农杆菌感受态细胞；取0.5～1μg质粒DNA加入含有200μL的EHA105农杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀；置于冰浴30分钟后，接着转入液氮中冷冻5分钟；迅速置于37℃水浴5分钟；加入600μL的LB液体培养基，控制转速为200r/min，温度为28℃振荡培养4h；将活化的农杆菌涂布于50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB固体培养基上，28℃倒置培养2～3天；挑选单克隆于500μL含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB液体培养基中，控制温度为28℃,转速为200r/min，振荡培养10h；吸取农杆菌培养液10ul于500ul含0.5mg/L卡娜霉素和20mg/L的利福平的LB液体培养基中，控制温度为28℃,转速为200r/min，振荡培养10h，如图2所示，用紫外分光光度仪测OD600；OD600在1.0～1.2，用注射器注射在莴苣和水稻叶片表面，观察症状。如图3和图4所示，结果显示该基因注射在莴苣和水稻叶片上，较对照都出现了病斑，所以确定该效应子及其编码基因在丝核菌致病过程中起作用。其中，溶液的配制：[1]LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂15g，补充蒸馏水至1000mL，调节pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min；[2]200倍的卡那霉素溶液：1L溶液中加入10g卡那霉素；200倍的利福平；1L溶液中加入4g利福平；[3]50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，其特征在于：包括如下1)或2)所示的蛋白质：1)由序列表1所示的氨基酸酸序列组成的蛋白质；2)由序列表1所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有转录激活功能的调控丝核菌致病的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，其特征在于：包括如下1)或2)所示的蛋白质：1)由序列表1所示的氨基酸酸序列组成的蛋白质；2)由序列表1所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有转录激活功能的调控丝核菌致病的蛋白质。2.根据权利要求1所述的与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，其特征在于：所述基因通过编码上述蛋白质。3.根据权利要求2所述的与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，其特征在于：所述基因其核苷酸序列如下1)、2)或3)所示：1)序列表2中的DNA序列；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质其DNA序列；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质其DNA序列。4.根据权利要求2或3所述的与立枯丝核菌致病相关的效应子R1YBXS8及其编码基因，其特征在于：含有所述基因的表达载体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：包文静，董文汉，杨根华，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53