一种使用来源于翻译控制肿瘤蛋白的特征多肽鉴别美国肉参的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用专属性肽段组鉴别美国肉参(Isostichopus badionotus)的方法，以及一组单独或组合使用时，可用来鉴别美国肉参的特征多肽，所述特征多肽为美国肉参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为美国肉参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的蛋白虽然发现有部分和植物或细菌等物种和其一致，但对比梅花参、海地瓜、刺参、墨西哥参时，所述特征多肽是美国肉参独有的。

Identification of American ginseng by using characteristic peptides derived from translation control of tumor proteins

The present invention relates to a method for identifying American Meat ginseng (Isostichopus badionotus) using an exclusive peptide group, and a group of individual or combined uses that can be used to identify the characteristic polypeptide of American Meat ginseng, the characteristic polypeptide is a low homologous polypeptide of American meoprotein, and the low homologous polypeptide fragment refers to the peptide segment. It is unique to American Meat ginseng, with a polypeptide fragment length of 5~30 amino acids. Although the protein is found to be in line with plants or bacteria and other species, the characteristic polypeptide is unique to American ginseng when compared with the ginseng, sea and cucumber, the ginseng, and Mexico ginseng.

【技术实现步骤摘要】
一种使用来源于翻译控制肿瘤蛋白的特征多肽鉴别美国肉参的方法本申请是中国专利技术申请“CN201610410893.6，一种使用专属性肽段组鉴别美国肉参的方法”的分案申请。
本专利技术属于生物
，具体而言，涉及一种使用专属性肽段组鉴别美国肉参(Isostichopusbadionotus)的方法。
技术介绍
海参富含酸性黏多糖，对人体有免疫调节剂、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。故此，海参享有“营养宝库”之美誉，现代人把海参誉为“海味八珍之首”。市场上海参种类繁多，不同海参因其营养价值、口感等不同而价格相差巨大。美国肉参是海参的一种，自然生长在冷水海域中，其生长期较长，一般为7-10年，故营养价值极高，除具一般海参拥有的富含蛋白质和多种微量元素的优点外，还具有参体肥壮，发涨率高，参肉厚实，口感爽滑等特点。是烹饪和药用俱佳的极品。不同品种的海参相比较，有的粘多糖含量高，对心脑血管有好处；有的皂甙含量高，对抗癌有益。海参同人参一样，如果皂甙含量高，则药用价值高，但可能味道不好；而有的海参蛋白质含量高，如茄参和刺参，可以大量用在宾馆和家庭餐桌上，对蛋白质缺乏、营养不良的人群提供身体所需的营养物质。由于目前缺乏特别有效的识别海参品种的方法，鉴别海参种类的方法还只是靠传统的外观观察，缺乏技术水平的支持，导致不少不良商人以次充好、以假充真欺骗消费者，因此需要一种高效准确的鉴定海参的方法。
技术实现思路
本专利技术对美国肉参(Isostichopusbadionotus)的肽段进行了研究，建立了从多肽水平对美国肉参进行鉴别的技术，填补了国内外海参鉴别的空白。本专利技术首先涉及一组单独或组合使用时，可用来鉴别美国肉参的特征多肽，所述特征多肽为美国肉参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为美国肉参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的蛋白为美国肉参中的如下蛋白：(1)actinisoform2、histoneH2B和glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase蛋白；(2)argininekinase、translationallycontrolledtumorprotein和majoryolkprotein2蛋白；(3)heat-shockprotein70和heat-shockproteingp96蛋白；(4)tropomyosin蛋白。优选的，所述来源于actinisoform2、histoneH2B和glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase蛋白的特征多肽，其序列为：SEQIDNO.1：EIAALAPPTMK；SEQIDNO.2：LCYVFLDFEQEMATAASSSSLEK；SEQIDNO.3：CDETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMK；SEQIDNO.4：ETYSIYIYK；SEQIDNO.5：AGIALSENFVK；SEQIDNO.6：VPVPDVSVVDLTLR。上述肽段1-6的m/z分别为：571.3；876.1；1069.5；393.9；574.8；754.9。优选的，所述来源于argininekinase、translationallycontrolledtumorprotein和majoryolkprotein2蛋白的特征多肽，其序列为：SEQIDNO.7：PYDDVLDPAYVISSR；SEQIDNO.8：IMDDVLDPAYVISSR；SEQIDNO.9：DVITGEELFSDSYK；SEQIDNO.10：LVDDLYWR；SEQIDNO.11：IGSVFESLNR；SEQIDNO.12：PVVFLNPER。上述肽段7-12的m/z分别为：855.4；565.3；801.9；540.3；561.3；535.8。优选的，所述来源于heat-shockprotein70和heat-shockproteingp96蛋白的特征多肽，其序列为：SEQIDNO.13：DAGVIAGLQVLR；SEQIDNO.14：SEIHELVLVGGSTR；SEQIDNO.15：VEIESFFDGEDFSETLTR；SEQIDNO.16：DDLVNNLGTIAK；SEQIDNO.17：EEAYDYLEPDTIEQLVK；SEQIDNO.18：YSQFINFPIYLWGSK。上述肽段13-18的m/z分别为：606.4；748.9；1061.0；636.8；1028.0；932.0。优选的，所述来源于tropomyosin蛋白的特征多肽，其序列为：SEQIDNO.19：MSELESQVTSSK；SEQIDNO.20：MSELESQVMGSK；SEQIDNO.21：QLESELDDTSEK；SEQIDNO.22：YDDIEQSSEESER；SEQIDNO.23：YNDIEQSSEESER。上述肽段19-23的m/z分别为：442.5；442.5；465.2；529.6；529.2。本专利技术还涉及一种检测美国肉参的方法，所述方法包括如下步骤：(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：(2)通过质谱法检验待测样本的多肽成分，分析样本中的美国肉参成分。所述的质谱前处理步骤如下：(1)称取1g海参样品均质成粉末状态，加入10mL蛋白提取液(8M尿素，50mMNH4HCO3)震荡提取蛋白，高速低温离心(20000r/min)，取上清液200ul转移到1mlEP管中；(2)取2μL1mol/LDTT加入到100μL上述蛋白溶液中37℃反应1小时；(3)取10μL现配的1mol/L的IAA(配置过程需避光，现用现配)加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；(4)采用10K滤膜20000g超滤30分钟，使用50mmol/L碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层，转移至新的EP管中；(5)再加入碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；(6)取5ulTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；(7)采用10K滤膜14000g超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。所述的质谱法检测为，采用ABSCIEX5600检测，流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，流速：0.25mL/min，TOF扫描范围：350-1500Da，正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，CurtainGas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。采用ABSCIEX三重四级杆检测，流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，流速：0.3mL/min，电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。所述的分析样本中的美国肉参成分为，将待测样品的质谱结果对比所述美国肉参蛋白的低同源性多肽片段(特征多肽)的标准质谱谱图，出现所述美国肉参蛋白的低同源性多肽片段的质谱检测谱图时，即可判断该组织样本为美国肉参样本。优选的，所述的美国肉参蛋白的低同源性多肽片段(特征多肽)为SEQIDNO.1～23所示的各条特异性多肽。本专利技术还涉及使用上述美国肉参蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组通过单独使用或组合使用对美国肉参(Isostichopus badionotus)进行鉴别的特征多肽，所述特征多肽为美国肉参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为美国肉参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的美国肉参蛋白为translationally controlled tumor protein蛋白，来源于translationally controlled tumor protein蛋白的特征多肽的序列为：SEQ ID NO.9：DVITGEELFSDSYK；SEQ ID NO.10：LVDDLYWR。

【技术特征摘要】
1.一组通过单独使用或组合使用对美国肉参(Isostichopusbadionotus)进行鉴别的特征多肽，所述特征多肽为美国肉参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为美国肉参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的美国肉参蛋白为translationallycontrolledtumorprotein蛋白，来源于translationallycontrolledtumorprotein蛋白的特征多肽的序列为：SEQIDNO.9：DVITGEELFSDSYK；SEQIDNO.10：LVDDLYWR。2.根据权利要求1所述的特征多肽，其特征在于，所述的SEQIDNO.9～10的多肽片段的m/z依次分别为：801.9；540.3。3.一种检测美国肉参的方法，所述方法包括如下步骤：(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液；(2)通过质谱法检验待测样本的多肽成分，分析样本中的刺参成分。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的质谱前处理步骤如下：(1)称取海参样品均质成粉末状态，加入蛋白提取液(8M尿素，50mMNH4HCO3)震荡提取蛋白，高速低温离心，取上清液转移到EP管中；(2)取DTT加入到上述蛋白溶液中，37℃反应1小时；(3)取现配的IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；(4)采用10K滤膜超滤30分钟，使用碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层，转移至新的EP管中；(5)再加入碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；(6)取Trypsin酶溶液加入到上述蛋白溶液，中37℃酶解16-18小时；(7)采用10K滤膜超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的质谱法检测为：采用A...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓梅，张鸿伟，程果，鲍蕾，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37