一种载药体系的合成方法及其新用途技术

本发明专利技术提供一种载药体系的合成方法，在TM缓冲液中混合等摩尔浓度的核酸适配体Aptamer、S1、S2、S3、S4、S5、S6以及三条AS1411分子，置于PCR仪中加热到95℃变性10 min，再迅速降到4℃，即可得到三种同时携带核酸适配体和AS1411的DNA四面体结构，即Aptamer‑AS1411‑DNA四面体。本发明专利技术将其应用于鼻咽癌药物上，并具体靶向CD44

A synthetic method of drug loading system and its new uses

The invention provides a synthetic method for the drug carrying system. In the TM buffer, the aptamers of aptamers Aptamer, S1, S2, S3, S4, S5, S6, and three AS1411 molecules are mixed with equal mole concentration. They are heated to the PCR instrument and heated to 95 degrees centigrade, 10, min and then rapidly down to 4, and three kinds of simultaneously carrying nucleic acid aptamers and AS1411 are obtained. Tetrahedral structure, that is, Aptamer, AS1411, DNA tetrahedron. The invention is applied to medicines for nasopharyngeal carcinoma and specifically targets CD44.

【技术实现步骤摘要】
一种载药体系的合成方法及其新用途
本专利技术提供一种具有四面体结构的载药体系的设计、制备及制药用途，属于生物医药

技术介绍
鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是目前发病率最高的头颈部恶性肿瘤。在世界范围内，其主要发病地区为中国南部、东南亚以及非洲的中东部和南部，尤其以中国南部粤语人群发病率最高，达25-30/10万；而大多数西方国家NPC的发病率较低。NPC对射线相对敏感，部分早期NPC患者经过单纯放射治疗后即可治愈；但晚期(Ⅲ、Ⅳ)NPC即使放化疗结合治疗，其5年生存率仍徘徊在10％～40％左右，治疗效果未从根本上得到改善。难治性NPC及转移性NPC的治疗仍然存在巨大的挑战。因此，对鼻咽癌新的治疗方法的探索尤为重要。相对于鼻咽黏膜正常上皮细胞，鼻咽癌肿瘤细胞往往会特异性的高表达某些分子标记。利用肿瘤细胞与正常细胞之间表面分子表达的这种差异性，能够设计特异性识别肿瘤细胞的靶向治疗策略，从而提高抗肿瘤药物在体内的选择性，实现鼻咽癌的靶向治疗。CD44蛋白是细胞外基质的主要成分，是一类跨膜单链糖蛋白，参与细胞-细胞/基质间的粘附，激活淋巴细胞归巢及细胞迁移。研究发现，CD44在多种肿瘤细胞表面过表达并与肿瘤发生发展及侵袭转移密切相关，是潜在的肿瘤治疗分子靶点。研究显示，CD44在NPC细胞中高表达并在NPC的发生发展过程中发挥重要作用，可用作独立的肿瘤不良预后指标。在本课题组的前期研究中，通过激光扫描共聚焦技术研究发现，在人鼻咽癌SUNE-15-8F细胞表面CD44过表达。体外实验证实，与CD44-细胞相比，CD44+细胞具有更强的增殖、侵袭和转移能力，以及对放化疗的抵抗性。这些研究提示：CD44+鼻咽癌细胞表现出类肿瘤干细胞物性，靶向CD44+肿瘤细胞的抗肿瘤治疗是颇具前景的鼻咽癌精准治疗策略。目前，最有效的靶向CD44的抗肿瘤策略是以抗CD44抗体作为靶头分子，将其与抗肿瘤药物耦联，从而将药物靶向传送至CD44高表达的肿瘤细胞中。然而，由于Ⅰ期临床试验中出现的各种强烈的毒副作用，相关的临床试验均已被叫停。究其原因，虽然CD44分子在肿瘤细胞中高表达，但是在正常人体组织细胞中也有表达，由于抗CD44抗体的特异性强，导致基于该策略的靶向药物难以避免地产生对正常细胞的非特异性杀伤副作用。据报道，CD44存在两种不同的状态：正常细胞表面CD44多处于静息态，而肿瘤细胞表面的CD44由于受到多种因素的影响而处于活化状态。因此，如能实现特异性识别肿瘤细胞表面处于活化状态的CD44，将为鼻咽癌的靶向治疗提供新的契机。核酸适配体是通过指数富集配基进化系统(SELEX)筛选得到的一段单链/双链寡聚核苷酸，它可以高亲和性、高特异性地与靶蛋白结合，故可作为靶头分子与药物载体相连接，并促进这些药物靶向进入肿瘤组织和肿瘤细胞之中。目前，以核酸适配体作为靶头分子构建高靶向性的药物递送系统是抗肿瘤研究的热点领域之一。有研究表明SELEX实验筛选获得的硫代修饰的DNA核酸适配体能够特异性识别肿瘤细胞表面CD44分子，如将其作为靶头分子将具有如下优势：(1)以肿瘤细胞为模型筛选获得，因此只有活化态CD44才能与其结合，而静息态则不能，由此避免了对正常细胞的毒副作用；(2)与天然配体相比，具有更高的靶标亲和力和特异性；(3)核酸适配体分子很小，可以在CD44介导下内吞入细胞内，将携带的药物靶向递送至肿瘤细胞内；(4)核酸是人体天然存在的物质，进入人体不会导致强烈的免疫反应。因此，与当前主流的针对CD44靶向治疗的抗体策略相比，基于核酸适配体的靶向治疗策略具有更加广阔的应用前景。目前常用于靶向治疗的药物递送载体主要为病毒载体和非病毒载体。病毒载体由于其潜在的致病性、免疫原性等缺点，使其应用受到局限；非病毒载体则存在生物相容性差、不易代谢，易在体内蓄积产生毒性等问题。因此，研发安全有效的靶向递送载体系统仍是目前靶向治疗亟需解决的重大问题之一。DNA不仅是生命体的遗传物质，还是组成生物纳米结构功能材料的理想元件。DNA纳米材料具有良好的机械性能，并富有可编程性和可控性。更为重要的是，该材料以人体固有的DNA作为原材料，具有很好的生物相容性和降解能力，对生物体毒害作用小；目前该DNA四面体作为药物转运载体在药物输送方面已经表现出很大的应用潜能。因此，DNA纳米药物载体的出现为药物靶向治疗提供了新的手段和途径。AS1411是一种正在研发中的抗肿瘤核酸适配体，由26个碱基组成。己经证实，AS1411对多种肿瘤细胞均能发挥明显的增殖抑制作用。进一步研究表明核仁素是AS1411的分子靶点。核仁素是核仁中含量最丰富的磷酸化蛋白，具有多种生物学功能：参与细胞增殖、生长以及抗细胞凋亡作用。有研究表明：AS1411的抗肿瘤作用机制为靶向抑制肿瘤细胞中核仁素的功能而阻止DNA损伤修复，继而诱发细胞凋亡而达到抑制肿瘤的目的。目前，AS1411作为一种新型的抗癌药物已经进入二期临床试验，试验结果显示AS1411的安全性及对各种实体癌具有很好的抗癌效果。综上所述，相对于正常细胞，鼻咽癌肿瘤细胞表面特异性的高表达CD44分子标记这一特征，为鼻咽癌靶向治疗策略的设计提供了条件。本研究工作的总体思路是，以DNA四面体结构作为药物载体的主体结构，研发新型抗肿瘤靶向载药体系。该载药体系通过DNA四面体每条边上伸出的手臂链，以碱基互补配对的方式将能靶向识别CD44分子的核酸适配体和能靶向抑制核仁素的核酸适配体AS1411组合修饰到DNA四面体上，由此构建一种新型抗鼻咽癌药物靶向递送体系。该载药体系将药物分子AS1411高效靶向递送至鼻咽癌细胞中，进而发挥抗肿瘤效应。本项目的成功实施，将研发出一种能特异性靶向鼻咽癌细胞的智能型、高效低毒的新型药物递送系统，为鼻咽癌的靶向治疗提供新技术和新途径，具有重要的临床应用前景。
技术实现思路
基于上述目的，本专利技术提供一种靶向药物，具体为四面体结构的载药复合物，具体为Aptamer-AS1411-DNA。优选为该载药体系的结构为Aptamer1-AS1411-DNA，该载药体系的结构为Aptamer1-AS1411-DNA具体是以一条Aptamer1和三条AS1411以碱基互补配对的方式同时连接到DNA四面体上。所述的Aptamer1为TGC*AG*ATGC*A*AGGT*A*ACC*AT*ATCC*A*A*AGC*A*AATTGATCTATGATCGTACGAT；三条AS1411为AS1411(1)、AS1411(2)、AS1411(3)，其中，AS1411(1)具体为GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTCGGAATGCAATACGACTGTA；AS1411(2)具体为GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGGAAAGCTTGTAGCTATAGTTA；AS1411(3)具体为GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGAGTTAAACATCGCATGTGCTT。或优选载药体系的结构为Aptamer2-AS1411-DNA，该载药体系的结构为Aptamer2-AS1411-DNA具体是以一条Aptamer2和三条AS1411以碱基互补配对的方式同时连接到DNA四本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种载药体系的合成方法，其特征在于，在TM缓冲液中混合等摩尔浓度的核酸适配体Aptamer、S1、S2、S3、S4、S5、S6以及三条AS1411分子，置于PCR仪中加热变性后再迅速降温，即可得到三种同时携带核酸适配体和AS1411的DNA四面体结构，即Aptamer‑AS1411‑DNA四面体。

【技术特征摘要】
1.一种载药体系的合成方法，其特征在于，在TM缓冲液中混合等摩尔浓度的核酸适配体Aptamer、S1、S2、S3、S4、S5、S6以及三条AS1411分子，置于PCR仪中加热变性后再迅速降温，即可得到三种同时携带核酸适配体和AS1411的DNA四面体结构，即Aptamer-AS1411-DNA四面体。2.权利要求1所述的载药体系的合成方法，其特征在于，所述的核酸适配体Aptamer包括Aptamer1、Aptamer2、Aptamer3。3.权利要求1所述的载药体系的合成方法，其特征在于，所述的AS1411包括AS1411(1)、AS1411(2)、AS1411(3)。4.权利要求1所述的载药体系的合成方法，其特征在于，所述的S1、S2、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：许新华，孙丽丹，袁程，徐璐，郭蓉，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42