本发明专利技术涉及一种烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养；步骤（3），烟草外植体组织培养；步骤（4），外植体防褐化培养。本发明专利技术的防褐化方法，不仅能有效降低褐化发生率，并且能明显缩短外植体分化芽点的出现时间，改善芽点的生长状态。整个工艺使用方便、成本低。
A method for anti browning of tobacco explants
The present invention relates to a method for anti browning of tobacco explants, including steps as follows: step (1), disinfection of seeds; step (2), seed culture; step (3), tissue culture of tobacco explants; step (4), explant anti browning culture. The anti browning method of the invention can not only effectively reduce the occurrence rate of browning, but also obviously shorten the appearance time of the explant differentiation bud point, and improve the growth state of the bud point. The whole process is easy to use and low in cost.
【技术实现步骤摘要】
一种烟草外植体防褐化方法
本专利技术涉及一种防褐化方法，尤其是一种烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。
技术介绍
烟草（Nicotianatabacum）为茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana）一年生或多年生的重要经济作物，由于具有易于组织培养和转化效率高等原因，成为当前植物基因工程领域中重要的模式植物。烟草在进行外源基因功能验证过程中，常常是利用叶盘法通过农杆菌介导导入外源基因后诱导抗性愈伤组织产生直至生出抗性小苗，这个过程一般都是在严格控温抑菌的室内组织瓶内进行，由于温度、湿度、病菌的种种因素的影响，外植体往往会发生褐变反应，进而影响后续工作的顺利进行。组织培养过程中外植体褐变是影响组织培养成功的重要因素。褐化是植物材料受伤后，体内释放的酚类物质在酚氧化酶的作用下被氧化成褐色的醌类物质的结果，对外植体材料将产生毒害作用，影响其生长和分化，严重时导致死亡。褐化主要与植物材料的基因型和生理状态、取材时期、培养基以及培养条件等有关，在植物组织培养中普遍存在。在试图解决褐化反应的方法中，研究和应用最多的是在培养基中添加防褐剂。不同种类和数量的防褐剂组合不恰当反而会影响植物本身生长，而且其他用途的物质加入可能会有难以预料的效果，值得探索。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种烟草外植体防褐化方法，在褐化问题得到有效缓解的同时，也能促进烟草外植体的健康生长。本专利技术采用解决技术问题方案如下：一种烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成外植体幼苗；步骤（3），烟草外植体组织培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗置于MS分化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织。步骤（4），外植体防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，MS防褐化培养基为MS基本培养基中加入0.5-1g/L硫代硫酸钠、0.2-0.5g/L聚乙烯基吡咯烷酮、5-10mg/L二硫苏糖醇、30g/L蔗糖、5g/L花生饼粉、3g/L豆饼粉和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。进一步地，步骤（1）中，取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。进一步地，步骤（2）中，所述MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。进一步地，步骤（3）中，所述外植体MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。进一步地，步骤（5）中，MS防褐化培养基的制备方法如下：A、配制1LMS防褐化培养基：将4.43gMS基本培养基、30g蔗糖、5g花生饼粉、3g豆饼粉、1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；B、添加0.5-1g/L硫代硫酸钠、0.2-0.5g/L聚乙烯基吡咯烷酮、5-10mg/L二硫苏糖醇和4g琼脂，121℃灭菌15min；C、灭菌后倒培养基。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术添加硫代硫酸钠(Na2S2O3)和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、二硫苏糖醇（DTT）在培养基中，同时采用花生饼粉、豆饼粉作为防褐化固体培养基成分，不仅可以有效缓解褐化现象，改善外植体整体的分化状态，同时花生饼粉、豆饼粉含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸、少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子，还能够作为有机氮源使用，能促进烟草外植体的健康生长。本专利技术的防褐化方法，不仅能有效降低褐化发生率，并且能明显缩短外植体分化芽点的出现时间，改善芽点的生长状态。整个工艺使用方便、成本低。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1本实施例的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成外植体幼苗，MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；步骤（3），烟草外植体组织培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗置于MS分化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织，MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；步骤（4），外植体防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，MS防褐化培养基为MS基本培养基中加入0.8g/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)、0.3g/L聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、8mg/L二硫苏糖醇、30g/L蔗糖、5g/L花生饼粉、3g/L豆饼粉和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；MS防褐化培养基的制备方法如下：A、配制1LMS防褐化培养基：将MS基本培养基4.43g、30g蔗糖、5g花生饼粉、3g豆饼粉和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；B、添加0.8g/L硫代硫酸钠（Na2S2O3）、0.3g/L聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、8mg/L二硫苏糖醇（DTT）和4g琼脂，121℃灭菌15min；C、灭菌后倒培养基，1L的MS防褐化培养基约可倒100mm培养皿30个，150mm培养皿10个，300mL培养瓶15个。本实施例的外植体7天后产生芽点，嫩绿色，芽点伸长生长较快，20天时，芽点伸长至0.5cm，鲜绿饱满，生长状态极佳，外植体褐化率为9.1％。对照实验：对照实验中不添加花生饼粉、豆饼粉，其余与实施例1方法相同，外植体19天后才产生芽点，并且芽点生长速度极慢，外植体褐化率为38.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30‑50μmol/(m
【技术特征摘要】
1.一种烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成外植体幼苗；步骤（3），烟草外植体组织培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗置于MS分化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织。步骤（4），外植体防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，MS防褐化培养基为MS基本培养基中加入0.5-1g/L硫代硫酸钠、0.2-0.5g/L聚乙烯基吡咯烷酮、5-10mg/L二硫苏糖醇、30g/L蔗糖、5g/L花生饼粉、3g/L豆饼粉和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。2.根据权利要求1所述的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（1）中，取...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾婉俐，张建铎，邓乐乐，张涛，高茜，许力，宋春满，蒋佳芮，向海英，陈章玉，李雪梅，夏庆友，贾凌，高军平，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53
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