青钱柳愈伤组织保存组培方法技术

本发明专利技术涉及一种青钱柳愈伤组织保存组培方法，包括外植体消毒、诱导培养和愈伤组织保存。在青钱柳愈伤组织培养过程中，经常出现愈伤组织褐化死亡、难保存等问题。我们在探讨青钱柳愈伤组织保存方法时，使用本发明专利技术的愈伤组织保存培养基改良MS+0.2～0.8mg/L 6‑BA+0.05～0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH 5.8。结果，青钱柳愈伤组织的增殖倍数达到4.80倍，褐化率为0.00％，愈伤组织生长好、繁殖速度快、不发生褐化死亡现象。本发明专利技术成功地解决了青钱柳愈伤组织易褐化死亡、难以继代和保存等问题，实用性强，推广性好。

Tissue culture method of tissue preservation of callus of penicus

The invention relates to a tissue culture method for callus of callus, including explant disinfection, induced culture and callus preservation. In the process of callus culture of callicum, there are many problems such as browning and death of callus. When we discuss the preservation methods of callus of Penicillium, we use this inventive callus preservation medium to improve MS+0.2 ~ 0.8mg/L 6 BA+0.05 ~ 0.2mg/L NAA+30g/L sucrose +7g/L agar, pH 5.8. The results showed that the multiplication factor of the callus was 4.80 times, the browning rate was 0%, the callus grew well, the propagation speed was fast, and the death of the callus did not occur. The invention successfully solves the problems of browning and death of the callus tissue, difficult to subculture and preserve, and has strong practicability and good generalization.

【技术实现步骤摘要】
青钱柳愈伤组织保存组培方法
本专利技术涉及一种青钱柳组织培养方法，具体涉及一种青钱柳愈伤组织保存组培方法。
技术介绍
青钱柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja)，又称为青钱李、摇钱树，属于胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属，不仅是我国独有的单种属乔木植物和国家重点保护二级濒危植物之一，也是集观赏、造林、药用、材用等多种用途的珍贵且经济树种。目前，青钱柳栽培主要是依靠种子繁殖，但具有深休眠特性的种子在播种后需隔年甚至2年后才能萌发，且种子空籽率高，仅有0.1-0.2％发芽率，出苗率不一致，这些导致青钱柳自然繁殖效率低，限制了青钱柳的栽培效率和推广。因此，迫切地需要一条高效的青钱柳培养途径。组织培养是青钱柳无性繁殖的有效途径，随着组织培养技术的发展，青钱柳离体培养研究也越来越受到关注。以叶片、茎尖、茎段等外植体进行离体培养时，均可诱导出愈伤组织或丛生芽(不定芽)。但是，青钱柳组织培养过程中，尤其是愈伤组织培养时，外植体和愈伤组织存在严重地褐化问题，使得在继代培养或增殖培养过程中愈伤组织繁殖系数不高、难保存，甚至死亡。可见，褐化已成为限制青钱柳组织培养成功开展的关键因素之一，同时也阻碍了青钱柳离体培养技术的推广。青钱柳愈伤组织离体培养时，抗氧化剂虽然能够抑制愈伤组织褐化的发生，但是尚未能成功地解决愈伤组织褐化问题。如：谢寅峰等使用维生素C(VC)、植酸(PA)和柠檬酸(CA)3种抗氧化剂均可抑制青钱柳愈伤组织褐化，以100mg/LVC处理效果较为明显，但其褐化率仍达到20.00％；王纪等指出使用200mg/LVc对抑制青钱柳愈伤组织褐化效果最好，褐化率仅为5.71％。但是，随着继代次数增加，愈伤组织褐化加重、增长量降低，质地也出现一些变化。因此，如何有效地解决愈伤组织褐化问题，且又有利于愈伤组织生长好易保存是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在青钱柳愈伤组织难以保存和褐化的问题，提供一种青钱柳愈伤组织保存组培方法，培养出良好的愈伤组织。本专利技术的目的是通过以下方法实现的。本专利技术的青钱柳愈伤组织保存组培方法，包括外植体消毒、诱导培养、愈伤组织保存，其特征在于所述愈伤组织保存培养基为改良MS+0.2～0.8mg/L6-BA+0.05～0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH5.8；改良MS为基本培养基，0.2～0.8mg/L6-BA+0.05～0.2mg/LNAA为激素组合；所述改良MS培养基配方如表1所示：表1改良MS培养基配方所述6-BA指6－苄氨基腺嘌吟；NAA指萘乙酸；GA指赤霉素；本专利技术的青钱柳愈伤组织保存组培方法，包括以下步骤：1、外植体消毒：取当年生且无病虫害的青钱柳新叶，先用体积比为75％的酒精表面消毒，再用重量比为0.1％升汞消毒3min，最后用无菌水冲洗3次；2、诱导培养：取步骤1消毒过的青钱柳叶片，切割成0.5～1.0cm×0.5cm的薄片，接种到诱导培养基上；培养室温度为25℃，光照12h/d，光照强度为1200lx～1500lx，培养30天；所述诱导培养基为改良MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LGA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH5.8；3、愈伤组织保存：从步骤2诱导的愈伤组织中，挑取新鲜且长势一致的愈伤组织，接种到愈伤组织保存培养基内进行继代培养；培养室温度为25℃，光照12h/d，光照强度为1200lx～1500lx，每隔40天转接一次；所述愈伤组织保存培养基的配方为改良MS+0.2～0.8mg/L6-BA+0.05～0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH5.8；其中，最佳愈伤组织保存培养基的配方为改良MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH5.8。在青钱柳愈伤组织培养过程中，经常出现愈伤组织褐化死亡、难保存等问题。为了探讨青钱柳愈伤组织保存的方法，我们在改良MS基础上，利用6-BA、NAA2个因素，通过完全随机试验，试验不同浓度的激素组合对青钱柳愈伤组织保存的影响。经多次试验和统计分析，不同6-BA+NAA激素组合对青钱柳愈伤组织保存的影响如表2所示。试验结果表明：愈伤组织保存培养基有利于愈伤组织的繁殖和生长；愈伤组织保存培养基中使用0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA激素组合对愈伤组织生长的效果为最好，愈伤组织的平均增殖倍数达到4.80倍，生长旺盛，不发生褐变，保存效果显著。所述增殖倍数指转接愈伤组织培养的总瓶数/原培养的愈伤组织总瓶数，褐化率指褐化的愈伤组织总团数/原培养的愈伤组织总团数×100％。表26-BA+NAA组合对青钱柳愈伤组织保存的影响注：差异显著性分析方法为Duncan新复极差，检测水平为P≤0.05。愈伤组织在保存培养基中表现出3类不同的质地，分别为：I类愈伤组织为红色、粉质状、质软且表面潮湿；II类愈伤组织黄绿色或黄色、颗粒状、质硬且表面干燥、颗粒小而紧密；III类愈伤组织为米白色、团块状、质软而表面湿润、块大而松散。“+”表明愈伤组织生活力和生长势越强。表2采用字母标记方法来表示多重比较结果，按照统计分析平均数多重比较标记字母法规定，用小写拉丁字母a、b、c、d......表示差异显著水平。先将各处理平均数由大到小排列，最大平均数后标记a，并将该平均数与以下各平均数相比，差异显著的依次标记b。依次类推，不显著的标记同一字母。两平均数之间凡有相同字母的即为差异不显著，否则为差异显著。选用表2筛选的最佳激素组合，即愈伤组织保存培养基为改良MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH5.8，与分别用改良MS1(大量元素是改良MS的1倍，其余元素含量不变)、改良MS2(大量元素是改良MS的1.5倍，其余元素含量不变)、改良MS3(大量元素是改良MS的2倍，其余元素含量不变)替代改良MS进行对比试验。试验结果表明，以含改良MS的培养基为佳，愈伤组织增殖倍数达到4.80倍，在含改良MS的培养基内培养的愈伤组织褐化率降低到0.00％，比谢寅峰等使用100mg/LVC培养愈伤组织的褐化率降低了20.00％。并且愈伤组织生长势最好，繁殖快，不发生褐化，能较长时间保持为愈伤特性。改良MS中随着大量元素含量增加，愈伤组织的增殖倍数越低，其中，含改良MS培养基的增殖倍数是含改良MS1、改良MS2培养基增殖倍数的3.04、68.57倍；且随着大量元素含量增加，愈伤组织的褐化率越高，含改良MS培养基的褐化率比含改良MS1、改良MS2、改良MS3培养基褐化率降低了34.17％、87.50％、100.00％。基本培养基对青钱柳愈伤组织保存的影响如表3所示：表3基本培养基对青钱柳愈伤组织保存的影响本专利技术的优点及有益之处。本专利技术的青钱柳愈伤组织保存的组培方法，具有如下有益效果：1、使用本专利技术的青钱柳愈伤组织保存培养基改良MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH5.8，青钱柳愈伤组织的增殖倍数达到4.80倍，褐化率为0.00％，愈伤组织生长好、繁殖速度快、不发生褐化死亡现象，可作为青钱柳愈伤组织继代本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青钱柳愈伤组织保存组培方法，包括外植体消毒、诱导培养、愈伤组织保存，其特征在于所述愈伤组织保存培养基为改良MS+0.2～0.8mg/L6‑BA+0.05～0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH 5.8；所述改良MS培养基配方如表1所示：表1改良MS培养基配方

【技术特征摘要】
1.一种青钱柳愈伤组织保存组培方法，包括外植体消毒、诱导培养、愈伤组织保存，其特征在于所述愈伤组织保存培养基为改良MS+0.2～0.8mg/L6-BA+0.05～0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂条，pH5.8；所述改良MS培养基配方如表1所示：表1改良MS培养基配方所述6-BA指6－苄氨基腺嘌吟；NAA指萘乙酸；GA指赤霉素。2.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯莹，桑庆亮，黄周英，钱莲文，袁建军，
申请(专利权)人：泉州师范学院，
类型：发明
国别省市：福建,35