TAT诱导的基于CRISPR/核酸内切酶的基因编辑制造技术

提供组合物和方法，用于通过至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域的截短的HIV LTR启动子进行的CRISPR相关核酸内切酶的Tat诱导型表达。该组合物可作为用于HIV的治疗和/预防的治疗性处理。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】TAT诱导的基于CRISPR/核酸内切酶的基因编辑
本专利技术涉及特异性裂解逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)中靶标序列的组合物。这些可包括核酸的组合物可给药至患有HIV感染或处于HIV感染风险下的受试者，其中，该核酸编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶以及与人免疫缺陷病毒中靶标序列互补的向导RNA序列。
技术介绍
自HIV-1发现以来，AIDS仍是世界范围内影响数百万人的主要公共健康问题。由于HIV-1永久性整合入宿主基因组中，AIDS尚不可治愈。目前，用于控制HIV-1感染和阻止AIDS发展的治疗(高活性的抗逆转录病毒治疗或HAART)极大地降低了细胞中支持HIV-1感染的病毒复制，并将血浆病毒血症降至最低水平。但HAART未能阻抑组织内低水平的病毒基因组表达和复制，且未能以被潜伏性感染的细胞如作为HIV-1积累池的休眠的记忆性T细胞、脑巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和肠相关淋巴样细胞为靶标。顽固性HIV-1感染也导致包括心脏和肾脏疾病、骨量减少、和神经障碍的并发症。对于以顽固性病毒储存库(reservoir)为靶标的有疗效的治疗策略存在持续需求。HIV-1基因组的长度约为9.8kb，包括当整合入宿主基因组时位于两端的两个病毒长末端重复序列。该基因组也包括编码结构蛋白(Gag、Pol和Env)、调节蛋白(Tat和Rev)、以及辅助蛋白(Vpu、Vpr、Vif和Nef)的基因。HIV-1转录的反式激活因子(Tat)是一种多功能蛋白，已经发现其促成HIV-1感染的若干病理学后果。Tat不仅在病毒转录和复制中扮演重要角色，它也能诱导多种细胞基因的表达且能作为神经毒性蛋白而起作用。Tat蛋白由被HIV-1感染的细胞分泌，且通过扩散穿过细胞膜而起作用。它可作为隐藏的、可溶的神经毒素而起作用，且诱导被HIV-1感染的巨噬细胞和小胶质细胞释放神经毒性物质。Tat转录由HIV-1LTR启动子驱动，且为HIV的整体病毒复制所需。HIV感染的临床进程可根据大量因素而变，该因素包括受试者的遗传背景、年龄、一般健康状况、营养情况、所接受的治疗、以及HIV亚型。通常，大多数个体在感染几周或几个月内发展出类似流感的症状。该症状可包括发热、头痛、肌痛、皮疹、发冷、咽喉痛、口腔或生殖器溃疡、淋巴结肿大、关节痛、盗汗、和腹泻。症状的强度可依据不同个体而从轻度到重度变化。在急性期过程中，HTV病毒颗粒被吸引至表达适宜的CD4受体分子的细胞并进入该细胞。一旦病毒进入宿主细胞，编码HIV的逆转录酶即生成HIVRNA的前病毒DNA副本，且该前病毒DNA副本变成被整合入该宿主细胞基因组DNA中。就是这一被该宿主细胞复制的HIV前病毒，导致了新的HIV病毒体的释放，该新的HIV病毒体可随后感染其它细胞。初次HIV感染在数周至数月内平息，但典型地，其后为可能延续长达10年的长期临床“潜伏”阶段。这一潜伏期也指代为无症状的HIV感染或慢性HIV感染。受试者的CD4淋巴细胞数回升但未至感染前的水平，且大多数受试者在感染2至4周内进行血清转化，换言之，他们体内具有可检测水平的抗HIV抗体。这一潜伏期过程中，在周边血液单核细胞中可能不存在可检测的病毒复制，且在周边血液中可能存在少量或没有可培养的病毒。该潜伏期过程中，也指代为临床潜伏阶段，感染有HIV的人们可能不经历HIV有关症状，或仅经历轻度症状。但是，HIV病毒持续在非常低的水平上繁殖。在已经使用抗逆转录病毒治疗进行治疗的受试者体内，这一潜伏期可延续数十年甚至更久。然而，即使处于这一阶段的受试者正在接受抗逆转录病毒治疗，他们仍能将HIV传播至其他人，但抗逆转录病毒治疗降低了传播的风险。CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列)是含有短反复碱基序列的DNA基因座。每一反复后跟随从前病毒曝露至病毒的“间隔DNA”的短片段。CRISPR一般与Cas基因相关，该Cas基因编码与CRISPR相关的蛋白质。该CRISPR/Cas系统是原核生物免疫系统，其赋予对外来遗传成分如质粒和噬菌体的抗性，并提供一种获取免疫性的形式。CRISPR间隔以类似于真核生物有机体中RNAi的方式来识别并切割这些外源性遗传成分。该CRISPR/Cas系统已经被用于多种有机体中的基因编辑(通过加入、中断或改变具体基因的序列)和基因调节。通过将该Cas9蛋白和适宜的向导RNA输送至细胞内，可在任何所希望的位置切割该有机体的基因组。使用CRISPR/Cas9系统的成功的治疗性基因编辑需要Cas9酶和向导RNA在靶标细胞中的有效且特异性的输送和表达。当组织或细胞集群中感受细胞的频率低时，如在某些被病毒感染的细胞的情境中，这尤其是一种挑战。
技术实现思路
本文提供一种在体内或体外将哺乳动物细胞内的人免疫缺陷病毒(HIV)灭活的方法。该方法包括将该哺乳动物细胞曝露于包括分离的核酸序列的组合物，分离的核酸序列编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶，该酶可操作地链接至截短的HIVLTR启动子，而该截短的启动子至少含有HIVLTR启动子的核心区域和TAR区域。具体实施例中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。该CRISPR相关核酸内切酶可被优化由于人细胞内表达。将该哺乳动物细胞曝露于该组合物可包括接触该细胞。该哺乳动物细胞可以是潜伏性感染的细胞，包括但不限于，CD4+T细胞、巨噬细胞、单核细胞、肠相关淋巴样细胞、小胶质细胞、和星形胶质细胞。该哺乳动物细胞可包括来自具有HIV感染的受试者的培养细胞、组织分离块、及/或细胞系。该HIV的灭活可在体内实施或间接体内实施。具体实施例中，该分离的核酸可额外编码一种或多种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。该HIV中靶标核酸序列可指代位于HIV的编码区域及/或非编码区域及/或长末端重复序列内的序列。该非编码区域可包括HIV的长末端重复序列。该位于HIV的长末端重复序列内的序列可包括位于U3区、R区、或U5区内的序列，这些区域不包括该截短的HIVLTR启动子的任何序列。该组合物可包括编码核定位信号的序列。该组合物可额外包括编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列，且该tracrRNA可与一编码向导RNA的序列融合。该组合物亦可包括该HIVLTR启动子的增强子区域。具体实施例中，该组合物可被可操作地链接至表达载体。该表达载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。本文提供一种分离的核酸序列，其包括编码CRISPR相关核酸内切酶的序列，该酶可操作地链接至截短的HIVLTR启动子，而该截短的启动子至少含有HIVLTR启动子的核心区域和TAR区域。具体实施例中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。该CRISPR相关核酸内切酶可被优化用于人细胞内表达。具体实施例中，该序列可额外编码一种或多种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。该HIV中靶标核酸序列可指代位于HIV的编码及/或非编码区域及/或长末端重复序列内的序列。该位于HIV的长末端重复序列内的序列可包括位于U3区、R区、或U5区内的序列，这些区域不包括该截短的HIVLTR启动子的任何序列。该分离的核酸序列亦可编码核定位信号及/或反式激活小RNA(tracrRNA)。该tracrRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在体内或体外将人免疫缺陷病毒(HIV)灭活的方法，该方法包含：向受试者给药包含分离的核酸序列的组合物或令哺乳动物细胞与该组合物接触，该分离的核酸序列编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶，该酶可操作地链接至截短的HIV长末端重复序列(LTR)启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和反式激活响应元件(TAR)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.20 US 62/136,0801.一种在体内或体外将人免疫缺陷病毒(HIV)灭活的方法，该方法包含：向受试者给药包含分离的核酸序列的组合物或令哺乳动物细胞与该组合物接触，该分离的核酸序列编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶，该酶可操作地链接至截短的HIV长末端重复序列(LTR)启动子，而该截短的启动子至少含有HIVLTR启动子的核心区域和反式激活响应元件(TAR)。2.如权利要求1所述的方法，其中，该分离的核酸序列进一步编码至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。3.如权利要求2所述的方法，其中，该HIV中的靶标核酸序列包含位于HIV编码区域或非编码区域内的序列。4.如权利要求3所述的方法，其中，该非编码区域包含HIV的长末端重复序列。5.如权利要求3所述的方法，其中，该靶标核酸序列包含位于HIV长末端重复序列内的序列。6.如权利要求5所述的方法，其中，该位于HIV长末端重复序列内的序列包含位于U3区、R区、或U5区内的序列，而这些区域不包括该截短的HIVLTR启动子的任何序列。7.如权利要求1所述的方法，其中，该哺乳动物细胞是潜伏性感染细胞。8.如权利要求7所述的方法，其中，该潜伏性感染细胞选自下列所组成的群组：CD4+T细胞、巨噬细胞、单核细胞、肠相关淋巴样细胞、小胶质细胞、和星形胶质细胞。9.如权利要求1所述的方法，其中，该灭活是体内灭活或间接体内灭活。10.如权利要求9所述的方法，其中，该哺乳动物细胞包含来自具备HIV感染的受试者的培养细胞、组织分离块、或细胞系。11.如权利要求1所述的方法，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。12.如权利要求1所述的方法，其中，该CRISPR相关核酸内切酶被优化用于人细胞内表达。13.如权利要求1所述的方法，其中，该组合物进一步包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列。14.如权利要求13所述的方法，其中，该tracrRNA与编码向导RNA的序列融合。15.如权利要求1所述的方法，其中，该组合物进一步包含编码核定位信号的序列。16.如权利要求1所述的方法，其中，该组合物可操作地链接至表达载体。17.如权利要求16所述的方法，其中，该表达载体选自下列所组成的群组：慢病毒载体、腺病毒载体、及腺病毒群载体。18.如权利要求1所述的方法，其中，该组合物进一步包含该HIV-1LTR启动子的增强子区域。19.一种分离的核酸序列，其包含编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶的序列，该酶可操作地链接至截短的人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子，而该截短的启动子至少含有HIVLTR启动子的核心区域和反式激活响应元件(TAR)。20.如权利要求19所述的分离的核酸序列，其中，该序列进一步编码至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。21.如权利要求20所述的分离的核酸序列，其中，该HIV中的靶标核酸序列包含位于HIV编码区域或非编码区域内的序列。22.如权利要求21所述的分离的核酸序列，其中，该非编码区域包含HIV的长末端重复序列或位于该HIV长末端重复序列内的序列。23.如权利要求22所述的分离的核酸序列，其中，该位于HIV长末端重复序列内的序列包含位于U3区、R区、或U5区内的序列，而这些区域不包括该截短的HIVLTR启动子的任何序列。24.如权利要求19所述的分离的核酸序列，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。25.如权利要求19所述的分离的核酸序列，其中，该CRISPR相关核酸内切酶被优化用于人细胞内表达。26.如权利要求19所述的分离的核酸序列，进一步包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列。27.如权利要求26所述的分离的核酸序列，其中，该tracrRNA与编码向导RNA的序列融合。28.如权利要求19所述的分离的核酸序列，进一步包含编码核定位信号的序列。29.如权利要求19所述的分离的核酸序列，其中，该分离的核酸序列可操作地链接至表达载体。30.如权利要求29所述的分离的核酸序列，其中，该表达载体选自下列所组成的群组：慢病毒载体、腺病毒载体、及腺病毒群载体。31.如权利要求19所述的分离的核酸序列，进一步包含该HIVLTR启动子的增强子区域。32.一种药物组合物，其包含编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶的核酸序列，该酶可操作地链接至截短的人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子，而该截短的启动子至少含有HIVLTR启动子的核心区域和反式激活响应元件(TAR)。33.如权利要求32所述的药物组合物，进一步包含药学可接受的载剂。34.如权利要求33所述的药物组合物，其中，该药学可接受的载剂包含基于脂质的胶体或基于聚合物的胶体。35.如权利要求34所述的药物组合物，其中，该胶体是脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒、或嵌段共聚物胶束。36.如权利要求32所述的药物组合物，其中，该药物组合物配制为外用。37.如权利要求32所述的药物组合物，其中，该药物组合物包含在避孕套内。38.如权利要求32所述的药物组合物，其中，该序列进一步编码至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。39.如权利要求38所述的药物组合物，其中，该HIV中靶标核酸序列包含位于HIV的编码区域或非编码区域内的序列。40.如权利要求39所述的药物组合物，其中，该非编码区域包含HIV的长末端重复序列。41.如权利要求40所述的药物组合物，其中，该靶标核酸序列包含位于该HIV长末端重复序列内的序列。42.如权利要求41所述的药物组合物，其中，该位于HIV长末端重复序列内的序列包含位于U3区、R区、或U5区内的序列，而这些区域不包括该截短的HIVLTR启动子的任何序列。43.如权利要求32所述的药物组合物，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。44.如权利要求32所述的药物组合物，其中，该CRISPR相关核酸内切酶被优化用于人细胞内表达。45.如权利要求32所述的药物组合物，进一步包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的核酸序列。46.如权利要求45所述的药物组合物，其中，该tracrRNA与编码向导RNA的序列融合。47.如权利要求32所述的药物组合物，进一步包含编码核定位信号的序列。48.如权利要求32所述的药物组合物，其中，该药物组合物可操作地链接至表达载体。49.如权利要求48所述的药物组合物，其中，该表达载体选自下列所组成的群组：慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。50.如权利要求32所述的药物组合物，其中，该序列进一步编码该HIV-1LTR启动子的增强子区域。51.一种治疗具有人免疫缺陷病毒(HIV)感染的受试者的方法，该方法包含向该受试者给药治疗有效量的包含核酸序列的药物组合物，该核酸序列编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶，该酶可操作地链接至截短的HIV长末端重复序列(LTR)启动子，而该截短的启动子至少含有HIVLTR启动子的核心区域和反式激活响应元件(TAR)。52.如权利要求51所述的治疗具有HIV感染的受试者的方法，其中，该序列进一步编码至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。53.如权利要求51所述的治疗具有HIV感染的受...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·哈利利，
申请(专利权)人：天普大学联邦高等教育系统，
类型：发明
国别省市：美国,US