利用人类外周血中DNA甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用人类外周血中DNA甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法。本发明专利技术方法不仅具有一定的精度，并且受外界因素影响较小。可以与传统方法互为补充，提高司法鉴定的准确度。

【技术实现步骤摘要】
利用人类外周血中DNA甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法
本专利技术涉及一种利用人类外周血中DNA甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法。
技术介绍
当前法医对刑事案件的时间推定，尤其是死亡时间的推定，主要通过如下手段并结合现场勘测等证据进行。超生反应：由于人体各种细胞、组织和器官对缺氧的耐受能力不一致，临床死亡发生后能存活的时间也不一样。因此能够根据还具有生活能力的组织、器官对外界刺激所发生的反应判断死亡时间。尸体现象：死亡后24小时内所发生的尸僵,尸斑，尸冷，自溶，角膜浑浊。死亡超过24小时发生的腐败，白骨化，尸蜡形成等死后生化改变：死亡后肌酸激酶与肌钙蛋白等物质的水平存在随死亡时间延长而增长的现象。其他还有如组织学改变，死前进餐时间等推定方法。但这些传统方法，都存在着一定的缺陷与不足，受周围环境的影响较大，时常不能给出较准确的时间推定。生物节律(Circadianrhythm)是一种内源性、持续的生理现象，呈现以约24小时为周期的变动。哺乳动物体内的细胞、组织、器官均存在生物节律，并随着外部环境的变化进行内源性的调整以保持相对的稳定性。因此，生物节律可以作为时间推定的一条新思路。哺乳动物生物节律的调控起搏点位于下丘脑区域的视交叉上核，与一些外周节律起搏器共同维持机体的生物节律。根据现有研究，下丘脑视交叉上核主要通过一些由“节律基因”组成的转录—翻译反馈调控网络来调节生物节律。DNA甲基化作为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA碱基序列的前提下改变表现型，在现有的研究中已证实，节律基因的甲基化水平与生物节律密切相关。专利技术内容本专利技术旨在克服和补充传统司法鉴定时间推定方法受环境影响过大的缺陷，提供一种利用人类外周血中DNA甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法。所述方法包括如下步骤：(1)检测正常人体外周血组织在不同时间点的DNA的甲基化水平；(2)根据步骤(1)的结果绘制标准曲线，所述标准曲线公式为：其中，Yij(t)是正常人体外周血组织i中CpG点j在时间点t的甲基化水平；μij为正常人体外周血组织CpG位点特异的均值，Rj为振幅，ξj是相位；对结果p值进行Bofferoni校正，对于CpG位点甲基化差异达到全基因组节律性表观显著水平的定义值为P<1.82e-7(＝0.05/275337)，而对于基因表达差异达到全基因组节律性遗传显著水平的定义为P<3.22e-6(＝0.05/15519)；(3)检测待测样本的DNA的甲基化水平Yij(t)；(4)将步骤(3)所测结果代入如下公式，通过计算得出时间点t，即为推算的案件发生时间：Yij(t)是样本i中CpG点j在时间点t的甲基化水平；μij为样本CpG位点特异的均值，Rj为振幅，ξj是相位；εij(t)是时间t点上的随机误差；对结果p值进行Bofferoni校正，对于CpG位点甲基化差异达到全基因组节律性表观显著水平的定义值为P<1.82e-7(＝0.05/275337)，而对于基因表达差异达到全基因组节律性遗传显著水平的定义为P<3.22e-6(＝0.05/15519)。检测人外周血样本甲基化水平的试剂为本领域常规试剂，检测方法为本领域常规方法。本专利技术通过检测人外周血样本甲基化水平，对刑事案件进行时间推定。将基因表达芯片和DNA甲基化芯片中校正后的结果分别拟合到24小时的标准曲线上，之后统计检测信号强度Yij(t)。得到结果发现在黄种人中，存在着408个节律性CpG位点，节律性CpG位点22点、24点时甲基化水平最高，而在10点、15点甲基化水平最低。根据该特征，对外周血样本的进行甲基化水平测定即能够得到相应的依据进行时间推定。本专利技术方法不仅具有一定的精度，并且受外界因素影响较小。可以与传统方法互为补充，提高司法鉴定的准确度。附图说明图1为基于正弦曲线模型和弹性网状回归分析模型获取的408个节律性CpG位点所预测的人体节律时间与真实时间的相关程度；图2为利用分析模型计算待测样本的节律时间，并检测与真实时间的相关程度。具体实施方式采集研究对象外周血DNA抽提与质检(QIAmapDNABloodMiniKit)1.取20μl蛋白酶K加入到1.5ml离心管中；2.加入200μl全血都离心管中；3.再加入200μlALbuffer到全血中；4.涡旋振荡15s,充分混匀；5.56℃孵育30min，每隔10min摇晃一次；6.将孵育后的离心管低速点离(<3000rpm)；7.加入200μl的无水乙醇到离心管中，涡旋振荡15s，低速点离(<3000rpm)；8.将上一步操作中离心管内的液体全部转移到吸附柱内，同时不要将液体粘在吸附柱外沿，8000rpm、1min，离心后将吸附柱移入到一个干净的2ml收集管中(试剂盒提供)；9.向吸附柱中加入500μlAW1buffer，同时不要将液体粘在吸附柱外沿，8000rpm、1min,离心后将吸附柱移入到一个干净的2ml收集管中(试剂盒提供)；10.向吸附柱中加入500μlAW2buffer，12000rpm、3min，弃去收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，12000rpm、1min；11.将吸附柱移入一个干净的1.5ml离心管内(自备)，向吸附柱内加入100μlAEbuffer，室温静置3-5min，8000rpm、1min，取收集管内液体，重新加入到吸附柱，室温静置2min，8000rpm、1min，取1.5μlDNA用做质量检测，其余置于-20℃冻存备用。亚硫酸氢盐预处理1.试剂准备：往试剂盒中的CTConversionReagent干粉试管中添加750μl无酶水，210μlM-DilutionBuffer。使用涡旋振荡器充分震荡，使粉末熔化至看不到冰晶，置于抽屉中避光备用；2.杂交炉准备：将杂交炉的温度调至37℃，使其能够提前升温备用；3.取200-500ngDNA，用水定容至45μl；4.添加5μlM-Dilution试剂混匀至45μlDNA中；5.置于提前预热好的37℃杂交炉中孵育15min；6.添加提前溶解好的CTConversionReagent100μl至孵育好的DNA中，使用枪吹打混匀，并将150μl体积混合液均分装成两管；7.使用PCR仪器过夜，条件：95℃、30s，(60℃、60min)*16cycle，4℃保存。8.试剂准备：添加24ml无水乙醇至6mlM-WashBuffer中备用；9.添加400μlM-BindingBuffer到试剂盒配套的过滤柱中，颠倒湿润柱子；10.把样品转入到已添加了BindingBuffer的柱子中，颠倒混匀，是BindingBuffer能够和DNA样品混合液充分混匀，10000g，20s离心；11.加入100μlM-WashBuffer至柱中，30s离心；12.加200μlM-DesμlphonationBuffer至柱中，室温静置15min，然后离心30s，丢弃收集管中的废弃液；13.添加200μlM-WashBuffer至柱中，离心30s，再添加200μlM-WashBuffer至柱中，离心30s；14.将柱子转移本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用人类外周血中DNA甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)检测正常人体外周血组织在不同时间点的DNA的甲基化水平；(2)根据步骤(1)的结果绘制标准曲线，所述标准曲线公式为：

【技术特征摘要】
1.一种利用人类外周血中DNA甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)检测正常人体外周血组织在不同时间点的DNA的甲基化水平；(2)根据步骤(1)的结果绘制标准曲线，所述标准曲线公式为：其中，Yij(t)是正常人体外周血组织i中CpG点j在时间点t的甲基化水平；μij为正常人体外周血组织CpG位点特异的均值，Rj为振幅，ξj是相位；对结果p值进行Bofferoni校正，对于CpG位点甲基化差异达到全基因组节律性表观显著水平的定义值为P&l...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈超，唐海燕，夏燕，徐煜宸，刘春宇，唐劲松，陈晓岗，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43