一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法技术

发明专利技术公开了一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，包括如下步骤：1)根据待测物性质，分别将量子点表面修饰相应的俘获抗体C‑QD和检测抗体D‑QD；2)将C‑QD和D‑QD加入样品中孵育10‑100分钟，形成C‑QD‑抗原‑D‑QD二聚体夹心结构；3)取溶液5微升滴于载玻片上，置于荧光显微镜下成像；4)以量子点的激发波长照射载玻片5－30min，在照射过程中记录量子点的成像及光谱蓝移和漂白过程；5)在过程中发生一次光谱分裂的光斑为量子点二聚体，不发生光谱分裂的为单个量子点；6)记算量子点二聚体占光斑总数的比例；本发明专利技术以量子点二聚体比例为定量基础，从而快速、灵敏、准确检测血液中抗原浓度。

【技术实现步骤摘要】
一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法
本专利技术涉及一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，属于生物化学和医学检测

技术介绍
免疫分析是生化分析、临床检测中使用最广泛的技术之一。它是利用抗原、抗体特异性结合后定性、定量检测抗原或抗体(可以是药物、激素、蛋白质、微生物等物质)的一种分析方法；一般通过测量抗原抗体复合体或游离抗体的含量进行待测物的定量分析。免疫分析按照操作步骤可以分为异相(heterogeneous)免疫分析和均相(homogeneous)免疫分析两类。前者需要分离手段将待测物与反应体系分离开后再进行检测，是现在免疫分析中的主流方法，具有灵敏度高，检测限低的优点；但其操作时间长，处理过程复杂，费时、费力。后者则一步完成，不需要分离，具有操作简单，时间短，可实现自动化等优点，但相对于非均相法灵敏度较差。夹心式免疫分析是常用的一种免疫分析形式，其主要特征是捕获抗体、检测抗体、抗原三者形成三明治状的夹心结构。均相免疫分析的核心要求是能利用光电磁等信号定量识别区分出反应体系中的抗原抗体复合体和游离抗体；信号识别的准确性和抗干扰性决定了检测方法的灵敏度和在复杂体系中的应用可行性。最近几年文献中报道了一些均相免疫分析方法，包括共振能量转移法、动态散射法、共振散射相关光谱、磁弛豫、化学发光法等。这些方法的问题在于检测限不够低，复杂体系中可靠性不够高、样品使用量较大。因此，发展一种微量血液中高灵敏均相免疫分析方法具有十分重要的意义。我们在2015年开发了利用量子点团聚程度进行生物素化蛋白质的定量方法【1】，2017年开发了利用阳离子胶束形成量子点团聚体进行肝素的定量方法【2】。这两篇文献与本专利技术存在较大不同：文献1提出了利用量子点团聚度进行蛋白定量的概念，利用生物素与链霉亲和素之间的相互作用形成团聚程度不同的量子点团聚体，生物素化的蛋白含量越高则量子点团聚程度越高；以团聚程度与生物素化蛋白之间的关系进行定量，仅能用于生物素化的蛋白定量。文献2中量子点修饰了肝素酶，与肝素特异结合，再通过肝素与阳离子胶束静电吸引形成量子点团聚体，通过计量团聚体的比例定量肝素。这个检测策略只适用于检测带有强电荷的生物大分子，不适用于蛋白。参考文献：【1】XingboShi,SuliDong,MinminLi,XiaojunLiu,QingquanZhang,WenfengZhao,ChenghuaZong,YewangZhang,HongweiGai*,Countingquantumdotaggregatesforthedetectionofbiotinylatedproteins,ChemicalCommunications,2015,51,2353-2356.【2】SuliDong,XiaojunLiu,QingquanZhang,WenfengZhao,ChenghuaZong,AiyeLiang,HongweiGai*,Sensingactiveheparinbycountingaggregatedquantumdotsatsingle-particlelevel,ACSSensors,2017,2,80-86.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，以量子点二聚体比例为定量基础，避免使用光、电、磁、力等信号的强度变化进行定量分析，降低信号波动带来的误差，从而快速、灵敏、准确检测血液中抗原浓度。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，包括如下步骤：1)根据待测物(抗原)性质，分别将量子点表面修饰相应的俘获抗体C-QD和检测抗体D-QD；2)将C-QD和D-QD加入样品中孵育10-100分钟，形成C-QD-抗原-D-QD二聚体夹心结构；3)取上述体系中溶液5微升滴于载玻片上，置于荧光显微镜下成像；4)以量子点的激发波长照射载玻片5－30min，在照射过程中记录量子点的成像及其光谱蓝移和漂白过程；5)在光谱蓝移和漂白的过程中发生一次光谱分裂的光斑为量子点二聚体，不发生光谱分裂的为单个量子点；6)记算量子点二聚体占光斑总数的比例，将此比例作为定量依据。本分析方法在均相溶液中一步一次性完成，无需抗体包埋固定、游离抗体分离。步骤2)中的二聚体夹心结构进行抗原检测，检测限摩尔浓度达到飞摩级别(fM)。所述的量子点为能发生光谱蓝移的量子点。所述的量子点二聚体通过量子点光谱蓝移过程中光谱分裂与否进行判断。所述的荧光显微镜配备光谱成像装置。与现有的方法相比：本方法将C-QD和D-QD加入到待测含有抗原的样品溶液中，随后以装配了光谱成像装置的荧光显微镜为检测平台，取样观察量子点二聚体比例，以二聚体比例与抗原浓度的关系作标准曲线，然后对未知样品中的抗原定量。本方法以二聚体比例而非荧光强度为定量基础，避免了荧光强度波动带来的误差，具有检测灵敏度高的优点，可达到fM级别。本方法为均相免疫分析，无需固定、分离、清洗等步骤；使用样品量少，只需几微升；并且避免使用光、电、磁、力等信号的强度变化进行定量分析，降低了信号波动带来的误差；在单颗粒水平上成像定量，检测限低、检测灵敏度高。附图说明图1为本专利技术分析方法原理示意图；图2为本专利技术单个量子点的漂白过程；图3为本专利技术量子点二聚体的光谱分裂过程；图4水溶液中不同浓度甲胎蛋白和癌胚抗原与量子点二聚体比例的相关性；图5标准加入法测量血清中甲胎蛋白和癌胚抗原含量。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如图1、图2、图3和图4所示，为一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，包括如下步骤：1)根据待测物(抗原)性质，分别将量子点表面修饰相应的俘获抗体C-QD和检测抗体D-QD，这里的量子点为能发生光谱蓝移的量子点，包括但不限于半导体核壳量子点；2)将C-QD和D-QD加入样品中孵育10-100分钟，形成C-QD-抗原-D-QD二聚体夹心结构；3)取上述体系中溶液5微升滴于载玻片上，置于荧光显微镜下成像，所述的荧光显微镜配备光谱成像装置；4)以量子点的激发波长照射载玻片5－30min，在照射过程中记录量子点的成像及其光谱蓝移和漂白过程，如图2和图3所示；图2，图3中左部分圆形光斑为量子点的零级光谱，右部分条纹状为量子点的一级光谱；一级光谱对应着该量子点的荧光光谱；在激发光的持续照射下，量子点发生氧化，光谱发生蓝移，表现为一级光谱向零级光斑移动(图2)；如果该光斑里的量子点是二聚体，这两个量子点的蓝移过程是不同步的，表现为本来重叠的一级光谱发生分裂(图3)；5)通过观察一级光谱的蓝移过程判断该光斑是否是二聚体：在光谱蓝移和漂白的过程中发生一次光谱分裂的光斑为量子点二聚体，不发生光谱分裂的为单个量子点；6)记算量子点二聚体占光斑总数的比例，将此比例作为定量依据，图4分别是癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)的定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，其特征在于：包括如下步骤：1)根据待测物(抗原)性质，分别将量子点表面修饰相应的俘获抗体C‑QD和检测抗体D‑QD；2)将C‑QD和D‑QD加入样品中孵育10‑100分钟，形成C‑QD‑抗原‑D‑QD二聚体夹心结构；3)取上述体系中溶液5微升滴于载玻片上，置于荧光显微镜下成像；4)以量子点的激发波长照射载玻片5－30min，在照射过程中记录量子点的成像及其光谱蓝移和漂白过程；5)在光谱蓝移和漂白的过程中发生一次光谱分裂的光斑为量子点二聚体，不发生光谱分裂的为单个量子点；6)记算量子点二聚体占光斑总数的比例，将此比例作为定量依据。

【技术特征摘要】
1.一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，其特征在于：包括如下步骤：1)根据待测物(抗原)性质，分别将量子点表面修饰相应的俘获抗体C-QD和检测抗体D-QD；2)将C-QD和D-QD加入样品中孵育10-100分钟，形成C-QD-抗原-D-QD二聚体夹心结构；3)取上述体系中溶液5微升滴于载玻片上，置于荧光显微镜下成像；4)以量子点的激发波长照射载玻片5－30min，在照射过程中记录量子点的成像及其光谱蓝移和漂白过程；5)在光谱蓝移和漂白的过程中发生一次光谱分裂的光斑为量子点二聚体，不发生光谱分裂的为单个量子点；6)记算量子点二聚体占光斑总数的比例，将此比例作为定量依据。2.根据权利要求1所述的一种单个纳米颗粒水平上的夹心式均相免疫分析方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：盖宏伟，刘晓君，黄聪慧，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32