水产品中利福平残留的超高效液相色谱串联质谱快速测定方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱‑串联质谱快速测定方法，包括以下步骤：样品提取，样品净化，带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备，将带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液以及样品待测液在相同的色谱、质谱条件下依次进行测定；采用串联四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)采集利福平的定量离子对和定性离子对信息；以多反应监测提取的利福平定量离子对与利福平稳定同位素内标物离子对的峰面积比值为纵坐标，利福平的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，将样品的利福平与内标物峰面积比值带入线性方程，获得样品中目标物的含量。

【技术实现步骤摘要】
水产品中利福平残留的超高效液相色谱串联质谱快速测定方法
本专利技术属于水产品检测
，具体涉及一种适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)快速测定方法。
技术介绍
利福平(Rifampicin,CAS:13292-46-1)是通过对利福霉素B进行化学改造后得到的一种半合成抗生素，属于安莎类抗生素且具有广谱的抗菌作用，能够用于治疗多种细菌感染性疾病，而且与其他药物之间无交叉抗药性，对结核病的疗效尤为突出，是治疗结核病的一线人用药物。利福平属于兽用禁用药物，我国于2005年发布的农业部公告第560号已将其列入兽药废止目录。但是利福平药物价格便宜，抗菌效果好，非常容易被养殖人员获取，因此该药在水产品养殖中存在人为非法使用的可能。近年来关于生物基质中利福平检测的相关研究报道较少，最新研究方法多采用超高效液相色谱-串联质谱法。如安静等人2015年在《中国临床药理学杂志》第31卷第21期发表了《超高效液相色谱质谱联用法测定儿童血浆中利福平、利福喷丁和利福布》的研究论文：该报道方法采用超高效液相色谱串联质谱法对血浆样品中的利福平进行检测，以扎来普隆为内标，采用HSST3色谱柱为分析柱，以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，以正离子多反应监测(MRM)模式进行质谱分析(离子对为m/z823.4>791.4)，血浆中利福平的检出限为50ng/mL。基质效应是生物样品进行质谱定量分析所面对的最主要问题，而内标法定量可以校正基质效应对检测的影响，其中目标化合物的稳定同位素(由分析物分子中原子被其稳定同位素，如2D,13C等取代后获得)是LC-MS/MS分析最适合的内标。安静等人的方法采用药物扎来普隆作为利福平测定的内标，内标色谱保留时间和利福平相差较大，基质效应校准值易发生偏离，不一定适用于除血浆外的其他生物基质。此外，按照欧盟EC/657/2002条例关于质谱检测准确定性需要4个确证点(IdentificationPoint，IP)的要求，上述方法仅有m/z823.4>791.4一对离子对，仅获得2分，假阳性风险较高。目前关于水产品中利福平残留的液相色谱-串联质谱检测方法未见报道，水产品生物基质种类多且复杂，现有的利福平检测方法并不能满足其检测需求。食品安全问题责任重大，缺乏准确有效的利福平检测技术为相关监管工作带来了巨大难度，因此建立一种稳定、可靠、准确的水产品中利福平测定方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种采用超高效液相色谱-串联质谱仪快速、准确地定性定量测定水产品中利福平的检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)快速测定方法，包括以下步骤：(A)、样品提取：称取2.5g均浆样品于离心管中，加入含有0.25μg利福平稳定同位素内标物的溶液(为浓度为1.0μg/mL利福平-D30.25mL)，静置后加入2～3g(较佳为2.5g)无水硫酸钠后采用7.5～12.5mL乙腈(较佳为8mL)作为试剂提取，漩涡震荡提取后，于4℃高速离心，移取上清液至比色管中，用乙腈定容至10mL～15mL(较佳为10mL)；(B)、样品净化：移取步骤(A)所得的提取液(部分)直接上样至OasisPRiMEHLB固相萃取柱上(保持流速1ml/20S)，收集全部流出液后于4℃高速离心，过0.2μm滤膜，得样品待测液；(C)、带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备：带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备方法为：先配制利福平浓度为0.0005～0.100μg/mL浓度梯度的利福平乙腈溶液作为标准溶液，然后再上述标准溶液中分别添加利福平稳定同位素内标工作溶液，从而使所得的带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液中，利福平稳定同位素内标(利福平-D3)的浓度均为0.025μg/mL；(D)、液相色谱-串联四级杆质谱仪测定：将带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液以及样品待测液在相同的色谱、质谱条件下依次进行测定；(E)、定性依据和定量分析：采用串联四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)采集利福平的定量离子对和定性离子对信息，实现定性和定量分析；以多反应监测提取的利福平定量离子对与利福平稳定同位素内标物(利福平-D3)离子对的峰面积比值为纵坐标，利福平的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，将样品的利福平与内标物峰面积比值带入线性方程，获得样品中目标物的含量。备注说明：按照欧盟EC/657/2002法规关于质谱定性需要4个确证点(IdentificationPoint，IP)的要求，低分辨质谱选择一个母离子，对应两个个子离子刚好能获得4分，即，LC-MS/MS分析方法选择一个母离子，对应两个子离子刚好能获得4个确证点，从而同时实现定性和定量分析。作为本专利技术的改进，所述步骤(C)中：色谱条件为：C18分析色谱柱2.1×100mm，2.6μm(AccucoreC18RP-MS，2.6μm，2.1×100mm)；柱温：40℃；流速：0.30mL/min；进样量：2μL；洗脱梯度：0～1.0min，30％B；1.0～5.0min，30％～90％B；5.0～6.0min，90％B；6.0～6.5min，90％～30％B；6.5～8.5min，30％B；流动相A为在5mmol/L乙酸铵水溶液且含0.02％的甲酸(体积分数)，即，每100mL的5mmol/L乙酸铵水溶液中添加0.02mL的甲酸；流动相B为纯乙腈；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；检测方式为正离子多反应监测(MRM)模式；电喷雾电压为5500kV；离子源温度为500～600℃；雾化器(GS1)压力为210kPa；辅助气(GS2)压力为280kPa；气帘气(CUR)压力为105kPa；利福平及同位素内标氘代利福平的质谱信息如下表(利福平与内标物的质谱分析参数表)；*定量离子。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(C)中，利福平稳定同位素内标工作溶液为浓度为1.0μg/mL的利福平-D3乙腈溶液。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(A)的高速离心为4000～6000r/min离心2～8分钟(较佳为5000r/min离心5分钟)，离心温度为4±1℃；所述步骤(B)的高速离心为10000～14000r/min高速离心8～12min(较佳为12000r/min离心10min)，离心温度为4±1℃。作为本专利技术的进一步改进，所述加入含有0.25μg利福平稳定同位素内标物的溶液为，加入浓度为1.0μg/mL利福平稳定同位素内标工作液0.25mL。本专利技术采用稳定同位素内标法定量，适用水产品多种基质，有效避免质谱基质效应对检测的影响。采用纯乙腈作为提取试剂，同时采用无水硫酸钠进行除水，保证利福平的稳定性。采用prime-hlb小柱对样品提取液进行净化，同时省略了氮吹步骤，提高了检测效率。本专利技术与现有技术相比具有以下显著效果：(1)本专利技术首次专利技术了通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱稳定同位素内标法测定水产品中的利福平残留，填补了技术空白。(2)本专利技术技术方案采用采用乙腈作为利福平的提取剂同时辅以本文档来自技高网...

【技术保护点】
适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱‑串联质谱快速测定方法，其特征在于包括以下步骤：(A)、样品提取：称取2.5g均浆样品于离心管中，加入含有0.25μg利福平稳定同位素内标物的溶液，静置后加入2～3g无水硫酸钠后采用7.5～12.5mL乙腈作为试剂提取，漩涡震荡提取后，于4±1℃高速离心，移取上清液至比色管中，用乙腈定容至10mL～15mL；(B)、样品净化：移取步骤(A)所得的提取液直接上样至Oasis PRiME HLB固相萃取柱上，收集全部流出液后于4±℃高速离心，过0.2μm滤膜，得样品待测液；(C)、带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备：带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备方法为：先配制利福平浓度为0.0005～0.100μg/mL浓度梯度的利福平乙腈溶液作为标准溶液，然后再上述标准溶液中分别添加利福平稳定同位素内标工作溶液，从而使所得的带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液中，利福平稳定同位素内标的浓度均为0.025μg/mL；(D)、液相色谱‑串联四级杆质谱仪测定：将带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液以及样品待测液在相同的色谱、质谱条件下依次进行测定；(E)、定性依据和定量分析：采用串联四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)采集利福平的定量离子对和定性离子对信息；以多反应监测提取的利福平定量离子对与利福平稳定同位素内标物离子对的峰面积比值为纵坐标，利福平的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，将样品的利福平与内标物峰面积比值带入线性方程，获得样品中目标物的含量。...

【技术特征摘要】
1.适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱快速测定方法，其特征在于包括以下步骤：(A)、样品提取：称取2.5g均浆样品于离心管中，加入含有0.25μg利福平稳定同位素内标物的溶液，静置后加入2～3g无水硫酸钠后采用7.5～12.5mL乙腈作为试剂提取，漩涡震荡提取后，于4±1℃高速离心，移取上清液至比色管中，用乙腈定容至10mL～15mL；(B)、样品净化：移取步骤(A)所得的提取液直接上样至OasisPRiMEHLB固相萃取柱上，收集全部流出液后于4±℃高速离心，过0.2μm滤膜，得样品待测液；(C)、带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备：带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备方法为：先配制利福平浓度为0.0005～0.100μg/mL浓度梯度的利福平乙腈溶液作为标准溶液，然后再上述标准溶液中分别添加利福平稳定同位素内标工作溶液，从而使所得的带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液中，利福平稳定同位素内标的浓度均为0.025μg/mL；(D)、液相色谱-串联四级杆质谱仪测定：将带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液以及样品待测液在相同的色谱、质谱条件下依次进行测定；(E)、定性依据和定量分析：采用串联四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)采集利福平的定量离子对和定性离子对信息；以多反应监测提取的利福平定量离子对与利福平稳定同位素内标物离子对的峰面积比值为纵坐标，利福平的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，将样品的利福平与内标物峰面积比值带入线性方程，获得样品中目标物的含量。2.根据权利要求1所述的适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李诗言，王扬，丁雪燕，吴洪喜，何中央，
申请(专利权)人：浙江省水产技术推广总站，
类型：发明
国别省市：浙江,33