一种强酸水解‑HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法技术

本发明专利技术公开一种强酸水解‑HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法，首先利用强酸将大蒜果聚糖彻底水解，通过HPLC法检测水解前后蔗糖、葡萄糖和果糖的含量并计算差值，根据差值计算大蒜组织中所有果聚糖的总含量。利用本发明专利技术建立的方法，不仅测定了不同聚合度的果聚糖总量，还降低了果聚糖标准品的费用，检测成本低，准确度高，操作简单，是一种易于推广的快速简便的大蒜果聚糖检测方法。

【技术实现步骤摘要】
一种强酸水解-HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法
分析检测领域，具体涉及一种强酸水解-HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法。
技术介绍
果聚糖是蔗糖与一个或多个果糖基相连接的线性或分支型的多聚体，是一类水溶性的非还原性碳水化合物。目前虽然在15％的被子植物中发现含有果聚糖，但其含量一般较低，果聚糖主要存在于百合科、菊科和禾本科植物中，如大蒜、洋葱、菊芋、小麦等组织中果聚糖的含量相对较高(Hendry,1993)。研究证实，大蒜鳞茎中含有大量果聚糖，占其干物质质量的75～80％(Losso&Nakai,1997)，是大蒜中含量最高的碳水化合物。根据聚合度(果糖基数目)的不同，果聚糖分为高聚果糖和低聚果糖。大蒜中的果聚糖以聚合度在3～9的低聚果糖为主，包括蔗果三糖、蔗果四糖、新蔗果三糖等(索慧,2010)。和果聚糖类似，大蒜中的低聚果糖是一种水溶性膳食纤维，其组分甜度高、热能低，能够促进肠道双歧杆菌增殖、抑制肠道有害细菌生长，具有极高的药用价值和保健功能(Bekersetal.,2004)。果聚糖作为大蒜鳞茎中含量最高的产量因子及活性成分，其含量及其变化对大蒜的品质及保健功能具有较大影响。然而，大蒜果聚糖组分多样，结构复杂，分离纯化难度大。因此建立一种快速、方便、准确的大蒜果聚糖含量检测方法显得尤为重要。目前测定植物果聚糖含量的方法，主要包括比色法、薄层色谱法(TLC)、试剂盒酶解法、高效液相色谱法(HPLC)及离子色谱法(HPAEC)。比色法基于不同类型的衍生反应，只能检测到少数糖类，对于组分复杂的果聚糖检测准确度不高；TLC法成本低，检测速度快，但其测定误差大，不适合用于果聚糖定量分析；试剂盒酶解法利用特殊的水解酶，准确度高，但水解酶价格昂贵，操作步骤复杂，不易于推广；HPLC法和HPAEC虽然具有灵敏度高、检出限低、分离效果好等优点，但其定量分析需要果聚糖每个组分的高纯度标准品，检测成本高，不适合测定多聚合度的果聚糖含量。在前人的研究中，HPLC法是应用最为广泛的果聚糖含量检测方法。例如，利用HPLC法能够测定烟草中单糖或二糖(孙雨安，2004；程勇，2010)、菊芋中聚合度≤5的果聚糖(梁明辉等，2012)以及大蒜中菊糖和聚合度≤4的果聚糖(方云花，2013)的含量。但这些检测都受到了果聚糖标准品的限制，未测定高聚合度的果聚糖含量，无法计算果聚糖总含量。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术提供一种强酸水解-HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法。利用本专利技术建立的方法，不仅测定了不同聚合度的果聚糖总量，还降低了果聚糖标准品的费用，检测成本低，准确度高，操作简单，是一种易于推广的快速简便的大蒜果聚糖检测方法。本专利技术所述方法通过如下技术方案实现：一种强酸水解-HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法，首先利用强酸将大蒜果聚糖彻底水解，通过HPLC法检测水解前后蔗糖、葡萄糖和果糖的含量并计算差值得到大蒜组织中所有果聚糖的总含量。本专利技术还提供一种具体的强酸水解-HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法，包含以下步骤：(1)将大蒜组织清洗后擦干，切片，100～110℃杀青10～20min，75～85℃烘干至恒重，粉碎，过35～45目筛形成大蒜组织干样；(2)取等量的两份步骤(1)制备的大蒜组织干样，向两份组织干样中分别加入蒸馏水和强酸溶液，95～105℃水解0.8～1.5h，冷却至室温，加入蒸馏水的组织干样形成待测样品A，加入强酸溶液的组织干样加入絮凝剂和碱调节pH至6.8～7.2定容到与待测样品A相同的体积形成待测样品B；(3)HPLC法分别检测步骤(2)待测样品A和待测样品B中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量，按照以下公式得到果聚糖的含量：果聚糖的含量(mg/gDW)＝(S1+G1+F1)－(S0+G0+F0)其中S1：待测样品B中蔗糖含量；G1：待测样品B中葡萄糖含量；F1：待测样品B中果糖含量；S0：待测样品A中蔗糖含量；G0：待测样品A中葡萄糖含量；F0：待测样品A中果糖含量。本专利技术步骤(2)所述强酸溶液可以为HCl溶液、硫酸溶液或三氯乙酸溶液，但由于硫酸具有强脱水性，可能会碳化蔗糖；而三氯乙酸对植物细胞壁多糖的水解具有专一性，利用三氯乙酸作为水解强酸，多糖可能水解不完全；故本专利技术所述方案优选HCl溶液为水解试剂。所述强酸溶液浓度优选为0.1～0.2mol/L，更优选为0.15～0.17mol/L。本专利技术步骤(2)中大蒜组织干样与蒸馏水或强酸溶液的加入量满足(25～50)mg/ml。本专利技术步骤(2)中所述碱可以为调节pH常用的碱，如NaOH。本专利技术步骤(2)中所述絮凝剂优选为Al2(SO4)3溶液；选择Al2(SO4)3作为絮凝剂，可以调节pH及沉淀剩余NaOH。所述絮凝剂的优选浓度为0.2～0.3mmol/L。本专利技术步骤(2)待测样品A和待测样品B在检测前过0.2μm微孔滤膜。本专利技术步骤(3)HPLC检测条件优选为：ShodexSUGARKS-801串KS-802色谱柱，示差检测器RID-10A，柱温80℃，进样量为10μL；流动相为超纯水，流速为1mL/min。本专利技术首次建立了一套大蒜植物样品果聚糖总量的检测流程。本专利技术利用强酸将不同聚合度的多种大蒜果聚糖彻底水解，通过水解前后双糖及单糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)含量差值的计算，快速准确地检测了大蒜组织中所有果聚糖的总含量。利用本专利技术建立的方法，不仅测定了不同聚合度的果聚糖总量，还降低了果聚糖标准品的费用，检测成本低，准确度高，操作简单，是一种易于推广的快速简便的大蒜果聚糖检测方法。附图说明图1：果糖标准曲线(葡萄糖浓度0.25～2mg/mL，2倍稀释倍数)横坐标以糖分浓度，纵坐标为峰面积。图2：葡萄糖标准曲线(葡萄糖浓度0.25～2mg/mL，2倍稀释倍数)横坐标以糖分浓度，纵坐标为峰面积。图3：蔗糖标准曲线(葡萄糖浓度0.25～2mg/mL，2倍稀释倍数)横坐标以糖分浓度，纵坐标为峰面积。图4：大蒜鳞茎水解前后的HPLC图(A：水解前，B：水解后)Suc：蔗糖；Glu：葡萄糖；Fru：果糖。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1样品：大蒜品种：乐都紫皮大蒜糖：蔗糖(SIGMA)、葡萄糖(SIGMA)、果糖(SIGMA)标准品试验方法：1.大蒜组织果聚糖的提取与水解：a.将大蒜鳞茎等鲜样蒸馏水清洗后用滤纸擦干，切片，105℃杀青15min，80℃烘干至恒重(约24h)，粉碎，过40目筛以备用。b.精确称取两份0.84g大蒜组织干样，分别放入25mL的玻璃试管A和试管B中，在试管A中加入20mL蒸馏水，在试管B中加入17.4mL蒸馏水和1mL3moL/L的HCl，将两个试管放进煮沸的水浴锅中，提取1h，冷却至室温后，在试管B中加入1mL3moL/L的NaOH和0.6mL8.75mmoL/L的Al2(SO4)3溶液平衡pH，定容至20mL。c.两试管中的反应物过0.2μm微孔滤膜，作为下一步检测的样品。以不加强酸未水解(试管A中的提取液)的样品作为对照。2.大蒜组织果聚糖的HPLC检测：将上一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种强酸水解‑HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法，其特征在于，首先利用强酸将大蒜果聚糖彻底水解，通过HPLC法检测水解前后蔗糖、葡萄糖和果糖的含量并计算差值得到大蒜组织中所有果聚糖的总含量。

【技术特征摘要】
1.一种强酸水解-HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法，其特征在于，首先利用强酸将大蒜果聚糖彻底水解，通过HPLC法检测水解前后蔗糖、葡萄糖和果糖的含量并计算差值得到大蒜组织中所有果聚糖的总含量。2.根据权利要求1所述的强酸水解-HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)将大蒜组织清洗后擦干，切片，100～110℃杀青10～20min，75～85℃烘干至恒重，粉碎，过35～45目筛形成大蒜组织干样；(2)取等量的两份步骤(1)制备的大蒜组织干样，向两份组织干样中分别加入蒸馏水和强酸溶液，95～105℃水解0.8～1.5h，冷却至室温，加入蒸馏水的组织干样形成待测样品A，加入强酸溶液的组织干样加入絮凝剂和碱调节pH至6.8～7.2并定容到与待测样品A相同的体积形成待测样品B；(3)HPLC法分别检测步骤(2)待测样品A和待测样品B中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量，按照以下公式得到果聚糖的含量：果聚糖的含量(mg/gDW)＝(S1+G1+F1)－(S0+G0+F0)其中S1：待测样品B中蔗糖含量；G1：待测样品B中葡萄糖含量；F1：待测样品B中果糖含量；S0：待测样品A中蔗糖含量；G0：待测样品A中葡萄糖含量；F0：待测样品A中果糖含量。3.根据权利要求2所述的强酸水解-HPLC法检测大蒜果聚糖含量的方法，其特征在于，步骤(2)所述强酸溶液为HC...

【专利技术属性】
技术研发人员：田洁，钟启文，田萌，王丽慧，杨世鹏，
申请(专利权)人：青海大学，青海省农林科学院，
类型：发明
国别省市：青海,63