一种应用斑马鱼毒性和代谢同步进程分析中药毒性作用新方法技术

本发明专利技术涉及一种用模式生物斑马鱼毒性评价和斑马鱼代谢同步进程法分析中药毒性作用的应用新方法，即用斑马鱼评价中药成分、组分或提取物的毒性过程中，同步动态分析代谢产物，评价中药及中药配伍毒性作用的同时，分析毒性的产生与成分变化的相关性，可发现中药中毒及配伍减毒的相关物质或原因。本发明专利技术克服现有斑马鱼毒性评价仅限于发现测试药对鱼形态、行为、死亡等毒性作用而未能同步分析测试药成分动态变化的缺陷，是一种操作方便、成本低、样品用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的斑马鱼毒性和代谢同步进程分析方法，可简单高效评价中药毒性同时发现代谢成分变化，发现致毒相关物质，亦可揭示中药配伍减毒的作用机制。

【技术实现步骤摘要】
一种应用斑马鱼毒性和代谢同步进程分析中药毒性作用新方法
本专利技术涉及一种用模式生物斑马鱼毒性评价和斑马鱼代谢同步进程法分析中药毒性作用的应用新方法，尤其是在用斑马鱼评价测试药毒性的过程中同步分析代谢产物，具体涉及斑马鱼毒性和代谢同步进程分析法，即用斑马鱼评价中药成分、组分或提取物的毒性过程中，同步动态分析代谢产物，评价中药及中药配伍毒性作用的同时，分析毒性的产生与成分变化的相关性，以发现中药中毒及配伍减毒的原因。
技术介绍
壮骨中药肝毒性受到关注，仙灵骨葆口服制剂引起的肝损伤风险于2016年12月药品不良反应信息通报发布，该制剂处方中重用君药淫羊藿(占整个组方的70％)，其潜在肝毒性风险逐渐显现，为临床应用带来巨大挑战[国家食品药品监督管理总局.警惕仙灵骨葆口服制剂引起的肝损伤风险。药物不良反应信息通报(第72期)，http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0078/167184.html]。早期发现中药潜在毒性，揭示中药中毒的物质基础，研究中药配伍减毒及其机制，对临床安全用药至关重要，但相关研究进展缓慢。药物的毒性产生与其在体内的代谢转化密切相关，但现有体内、体外模型难以进行毒性与代谢的实时、动态同步观察，是制约中药毒性物质发现的难点、瓶颈：体内毒性实验周期较长、成本高、化合物用量大，不适于高效的毒性筛选及代谢动态检测；体外实验不能体现在体代谢的综合效果，无法进行毒性和代谢同步分析。斑马鱼(zebrafish)是近年来进行药物在体高通量筛选、毒性和代谢研究等热门模式生物。斑马鱼发育速度快，在1周内形成主要的脏器及代谢酶系，幼鱼体小透明，实验可在微板中进行并实时动态观察。我们之前专利[ZL201010258459.3，CN201210202465.6，CN201210187191.8]公开了“斑马鱼药物代谢新方法”，该方法突破了量微成分难以进行在体代谢的瓶颈，具简单、高效、低成本、化合物用量少(μg～mg)的优势，药液基质干扰小等优势。斑马鱼毒性评价法已在国内、外广泛用于药物的安全性评价。与哺乳动物类似，药物经斑马鱼作用后发生代谢转化，产生药效或毒性，故采用斑马鱼进行毒性动态评价的同时可同步分析代谢物，即实现斑马鱼毒性和代谢同步进程分析。现有斑马鱼毒性评价仅限于给予测试药后的鱼形态、行为、死亡情况等毒性指标，而未见同步分析测试药成分动态变化，不能发现毒性的产生与成分的相关性，从而不能揭示测试药致毒的相关物质基础，也不能揭示中药配伍后毒性的变化与成分变化的相关性，从而难于揭示配伍减毒机制。综上，我们课题组建立了斑马鱼代谢方法，斑马鱼评价药物毒性已被国内外认可并应用，在斑马鱼毒性评价过程中，药物也经斑马鱼作用发生代谢转化，故药物的斑马鱼毒性评价和代谢分析可同步进行，有利于发现致毒相关物质。整个实验样品用量少(μg至几mg)，即用斑马鱼可实现量微样品的毒性与代谢同步动态分析。这方面研究在国内尚属空白。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作方便、成本低、样品用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的中药斑马鱼毒性与代谢同步进程分析方法，以期简单、高效评价中药毒性同时发现代谢成分变化，发现致毒相关物质，亦可揭示中药配伍减毒与代谢相关的作用机制。技术方案：为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为：一种斑马鱼毒性评价和代谢产物同步进程分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14-12小时：10-12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26℃-30℃恒温培养箱中培养；步骤二：给药方案：取受精后1天(1dpf)斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基1-2mL，每个孔里放6-10条幼鱼，分为数组，溶媒阴性对照组和测试药物组，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26℃-30℃恒温培养箱中培养，培养周期5-7天，必要时隔1-3天将每个孔里的溶液用移液枪吸出部分，再加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后3-8天；步骤三：斑马鱼给药期间(受精后1天到受精后8天)定时每天或隔天取药液和鱼体，药液吹干，鱼体匀浆后吹干，加溶剂溶解，高速离心或用微孔滤膜过滤后，取上清液或滤液，采用高效液相色谱或联用质谱技术分析代谢产物。步骤四：斑马鱼毒性评价：斑马鱼给药期间(受精后1天到受精后8天)，每天计数鱼死亡数量，用SPSS16.0软件计算各测试药给药后的动态斑马鱼半数致死浓度LC50。定时用显微镜观察主要脏器形态变化或斑马鱼行为变化。步骤五：斑马鱼毒性评价和斑马鱼代谢的相关分析：将斑马鱼毒性结果如死亡率或半数致死浓度LC50与经斑马鱼作用后的测试药成分代谢动态变化进行相关分析，分析致毒的相关成分。作为优选方案，其中步骤(1)和(2)所述的培养温度为26℃-29℃。作为优选方案，其中步骤(2)所述的培养板为96孔、48孔、24孔、12孔或6孔培养板，其中较优的为24孔板，每孔加入培养基1-2mL，每孔放5-10条幼鱼。作为优选方案，其中步骤(2)所述的溶媒为水或者是含有0～1％二甲基亚砜(DMSO)助溶剂的水溶液。对于水溶性较差的药物，采用二甲基亚砜助溶，可以有效提高药物的水溶性，使药物均匀分散于水溶中。作为优选方案，步骤(2)中斑马鱼鱼龄选择受精后1天的斑马鱼胚胎或斑马鱼幼鱼，培养周期为4-5天，培养至受精后5-6天。作为优选方案，步骤(3)中取样时间为给药后每天取药液，必要时取鱼体。取样时间点为受精后1天到受精后6天，每天连续取样。作为优选方案，步骤(3)中吹干后的药液或鱼体，用含50％至100％甲醇的水溶液溶解，于每分钟10000转至29000转离心10到20分钟，或用0.2-0.45μm的微孔滤膜过滤，离心后上清液或过滤后滤液，用高效液相色谱仪或联用质谱仪分析代谢产物。作为优选方案，毒性观察时间可为受精后1-6天，每天计数鱼死亡数量，观察鱼行为或形态变化，在受精后2天-4天在显微镜下观察并拍照。作为优选方案，本专利技术所述的斑马鱼毒性和代谢同步进程分析法受试药物为量微成分、组分、中药提取物或配伍其它中药的毒性与代谢同步分析。所述的受试药物为淫羊藿的代表黄酮成分、淫羊藿总黄酮、淫羊藿水煎液及分别配伍巴戟天水煎液。研究拟选择抗骨质疏松活性明确且有肝毒风险的知名壮骨中药淫羊藿为代表。淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim.)、箭叶淫羊藿[Epimediumsagittatum(Sieb.etZucc.)Maxim.]、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim.)或朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥地上部分。具补肾阳，强筋骨，祛风湿之功效。近年来，临床用量大、社会关注度广的淫羊藿潜在肝毒性已引起重视[王伽伯，肖小河，杜晓曦，邹正升，宋海波，郭晓昕。基于转化毒理学的中药肝损害客观辨识与早期诊断.中国中药杂志，2014，39(1)：5-9。]。淫羊藿化学成分复杂，主含黄酮类、多糖、有机酸及生物碱等成分，其中淫羊藿黄酮成分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用斑马鱼毒性和代谢同步进程分析中药毒性作用的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14‑12小时：10‑12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26℃‑30℃恒温培养箱中培养；步骤二：给药方案：取受精后1天1dpf斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基1‑2mL，每个孔里放6‑10条幼鱼，分为数组，溶媒阴性对照组和测试药物组，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26℃‑30℃恒温培养箱中培养，培养周期5‑7天，必要时隔1‑3天将每个孔里的溶液用移液枪吸出部分，再加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后3‑8天；步骤三：斑马鱼给药期间受精后1天到受精后8天，定时每天或隔天取药液和鱼体，药液吹干，鱼体匀浆后吹干，加溶剂溶解，高速离心或用微孔滤膜过滤后，取上清液或滤液，采用高效液相色谱或联用质谱技术分析代谢产物；步骤四：斑马鱼毒性评价：斑马鱼给药期间受精后1天到受精后8天，每天计数鱼死亡数量，用SPSS16.0软件计算各测试药给药后的动态斑马鱼半数致死浓度LC50。定时用显微镜观察主要脏器形态变化或斑马鱼行为变化；步骤五：斑马鱼毒性评价和斑马鱼代谢的相关分析：将斑马鱼毒性结果如死亡率或半数致死浓度LC50与经斑马鱼作用后的测试药成分代谢动态变化进行相关分析，分析致毒的相关成分。...

【技术特征摘要】
1.一种应用斑马鱼毒性和代谢同步进程分析中药毒性作用的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14-12小时：10-12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26℃-30℃恒温培养箱中培养；步骤二：给药方案：取受精后1天1dpf斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基1-2mL，每个孔里放6-10条幼鱼，分为数组，溶媒阴性对照组和测试药物组，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26℃-30℃恒温培养箱中培养，培养周期5-7天，必要时隔1-3天将每个孔里的溶液用移液枪吸出部分，再加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后3-8天；步骤三：斑马鱼给...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦英杰，凌洁，陈颖，
申请(专利权)人：江苏省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32