细菌多环芳烃代谢产物高效提取及降解途径判定方法技术

本发明专利技术公开了一种细菌多环芳烃代谢产物高效提取及降解途径判定方法；测定多环芳烃降解产物的方法，包括以下步骤：以菲/芘为唯一碳源对降解菌进行培养；提取降解产物；HPLC上机检测，通过标样确定物质出峰时间及检测下限，并通过标线换算降解产物含量，计算污染物降解途径比例。本发明专利技术的方法能用于评估菌株存在新降解途径的可能，为进一步探索降解途径、采用微生物治理多环芳烃污染提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】
细菌多环芳烃代谢产物高效提取及降解途径判定方法
本专利技术属于生物化学分析领域，具体涉及一种简单高效提取培养基中多环芳烃降解产物的方法及一种判定多环芳烃降解途径比例的方法。
技术介绍
多环芳烃(PolycyclicAromaticHydrocarbons，PAHs)是指两个及两个以上苯环以稠环形式相连的化合物，属国际公约规制的持久性有机污染物(PersistentOrganicPollutants，POPs)，主要来源于化石燃料、煤气和煤焦油的生产、木料加工、石油泄漏以及废物焚烧等，具有致癌性、致畸性、致突变性，可长久存在于大气、水体和土壤中，给人类健康和生态环境带来危害。因此，如何治理环境中的PAHs，降低环境风险，日益受到人们的重视。治理环境中多环芳烃的技术可分为物理方法、化学方法、生物方法。其中，生物方法中的微生物修复，因其成本低、高效、二次污染少，已逐渐成为有效解决多环芳烃污染的主要手段。研究微生物对多环芳烃的代谢转化，阐明其降解机理，对进一步利用微生物修复多环芳烃环境污染，并评估原位修复中中间代谢产物可能带来的风险具有重要意义。提取微生物多环芳烃代谢产物作为较为关键的步骤，直接影响了下游分析中对代谢途径的揭示。目前，较为普遍的多环芳烃降解产物提取方法有：一、高速离心去除菌体后对培养基上清进行萃取提取。二、直接向培养基中添加等体积的有机溶剂(甲醇、正己烷、乙酸乙酯等)萃取或溶解提取。上述两种方法均未考虑菌体体内的代谢产物，且部分提取方法还需按酸碱性分步提取，操作繁琐耗时长，大大降低了对代谢产物提取效率。如何优化代谢产物提取方法尽可能完整地获取代谢产物，是探索多环芳烃代谢产物方法中较为关键的环节，也是进一步对降解产物进行鉴定的前提。高效提取降解产物后，如何进一步对降解产物进行分析，是评估降解菌株价值的基础。目前，较为高效的一种检测分析手段为高效液相色谱-质谱连用技术(HighPerformanceLiquidChromatography-Mass,HPLC-MS)，该技术分离效率高、选择性好、检测灵敏度高，在揭示降解途径中具有一定优势。通过优化高效液相色谱测定条件，提高多种降解产物分离度，为进一步解析降解产物、探究新降解途径具有重要意义；与此同时，如何与已报道降解途径进行比对，判定菌株代谢途径中已报道降解途径所占比例，是为进一步判定新降解途径存在可能的依据。两者皆是解析多环芳烃降解菌降解途径中重要的步骤，对于高效利用微生物修复多环芳烃环境污染具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种高效提取细菌多环芳烃代谢产物并判定降解途径比例的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种测定多环芳烃降解产物的方法，包括以下步骤：1)、以菲/芘为唯一碳源对降解菌进行培养：制备浓度为(1～10)×108CFUmL-1的菲或芘的降解菌菌悬液；将1mL的上述降解菌菌悬液与9mL的含菲/芘的矿质培养基在容器内混合后放入恒温振荡器中于28±1℃、130±30rpm条件下培养至污染物被降解完全(视菌株降解情况而定，约为12～72小时)；含菲的矿质培养基中，菲浓度为100±10mgL-1；含芘的矿质培养基中，芘浓度为50±5mgL-1；备注说明：菲的降解菌菌悬液配用菲的矿质培养基，芘的降解菌菌悬液配用芘的矿质培养基；判断污染物是否被降解完全，可依据现有的HPLC测定法；2)、提取降解产物：将步骤1)所得的装有以菲/芘为唯一碳源菌液的容器从恒温振荡器中取出；向容器(含10mL培养体系)中添加1mL6molL-1NaOH溶液，超声10±2min；添加2mL6molL-1HCl溶液混匀；添加10mL乙酸乙酯，超声10±2min；将容器内的所有液体转移至棕色玻璃离心管Ⅰ(50mL的规格)中，并用5mL乙酸乙酯润洗原容器内壁后将其合并至棕色离心管Ⅰ中；室温条件下以3500±500rpm转速离心；将离心所得的上层有机相通过含有无水Na2SO4的针筒后，收集至棕色玻璃离心管Ⅱ(50mL的规格)中，氮吹至乙酸乙酯完全挥发；再加入2mL乙腈从而溶解洗涤并溶解棕色玻璃离心管Ⅱ内的物质；过0.22μm有机相膜后上机测定；备注说明：10mL培养体系包含菌体、未降解的菲或芘、中间降解产物、矿质培养基中的盐分和水；3)、HPLC上机检测：分别配置流动相A(有机流动相)和流动相B(无机流动相)，A为乙腈+1‰甲酸(V/V)；B为水+1‰甲酸(V/V)，脱气30±5min后使用；按照下表设置HPLC流动相梯度洗脱：柱温为30℃，紫外检测器分别检测254nm和280nm波段吸光度变化；通过标样确定物质出峰时间及检测下限，并通过标线换算降解产物含量，计算污染物降解途径比例。备注说明：上述流动相的含量，以“0～12min流动相A”为例，是指从“10％”均匀递增至“34％”。作为本专利技术的测定多环芳烃降解产物的方法的改进：所述步骤1)中的矿质培养基为：称取0.50gNaNO3，1.00gKH2PO4，0.02gCaCl2，0.20gMgSO4，0.50g(NH4)2SO4，1.00gNaH2PO4·H2O溶解于1L去离子水中，搅拌混匀后，调节pH至6.5(采用浓度为6molL-1的氢氧化钠溶液进行调节)。作为本专利技术的测定多环芳烃降解产物的方法的进一步改进：所述步骤1)中浓度为(1～10)×108CFUmL-1的菲或芘的降解菌菌悬液的制备方法为：吸取200μL25％甘油保存菌种于20mLLB培养基中，在28℃130rpm条件下活化培养12h；吸取200μL活化菌液转入新的20mLLB培养基中，在28℃130rpm条件下培养14～16h获得菌液；在4℃5000rpm条件下将菌液离心10min，获得降解菌；将获得菌体采用无菌水涡旋，将菌体重悬于无菌水中；再次离心，重复该步骤两次，最后将菌体重悬于无菌水中获得菌悬液；调节菌悬液在紫外分光光度计OD600nm的值，从而获得所需浓度的菌悬液(较佳为OD600nm＝1.0，此时菌体浓度约为5×108CFUmL-1)。作为本专利技术的测定多环芳烃降解产物的方法的进一步改进：所述步骤3)中的各物质出峰时间、检测下限、标线如下表所示：本专利技术还同时提供了利用上述方法测定所得的多环芳烃降解产物含量来判定降解途径比例的方法：获得降解产物含量后，按以下公式进行降解途径比例换算(以10mL培养体系为例)：1-羟基-2-萘甲酸途径比例＝[1-羟基-2-萘甲酸浓度(mgL-1)/1000×10mL/1000/188.18]÷[降解芘/菲浓度(mgL-1))/1000×10mL/1000/202.25或178.23]；邻苯二甲酸途径比例＝[邻苯二甲酸浓度(mgL-1)/1000×10mL/1000/166.13]÷[降解芘/菲浓度(mgL-1))/1000×10mL/1000/202.25或178.23]；水杨酸途径比例＝[邻苯二甲酸浓度(mgL-1)/1000×10mL/1000/138.12]÷[降解芘/菲浓度(mgL-1))/1000×10mL/1000/202.25或178.23]；2,2’-联苯二羧酸途径比例＝[2,2’-联苯二羧酸浓度(mgL-1)/1000×10mL/1000/242.23]÷[降解芘/菲浓度(mgL-本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定多环芳烃降解产物的方法，其特征是包括以下步骤：1)、以菲/芘为唯一碳源对降解菌进行培养：制备浓度为(1～10)×10

【技术特征摘要】
1.测定多环芳烃降解产物的方法，其特征是包括以下步骤：1)、以菲/芘为唯一碳源对降解菌进行培养：制备浓度为(1～10)×108CFUmL-1的菲或芘的降解菌菌悬液；将1mL的上述降解菌菌悬液与9mL的含菲/芘的矿质培养基在容器内混合后放入恒温振荡器中于28±1℃、130±30rpm条件下培养至污染物被降解完全；含菲的矿质培养基中，菲浓度为100±10mgL-1；含芘的矿质培养基中，芘浓度为50±5mgL-1；2)、提取降解产物：将步骤1)所得的装有以菲/芘为唯一碳源菌液的容器从恒温振荡器中取出；向容器内培养体系中添加1mL6molL-1NaOH溶液，超声10±2min；添加2mL6molL-1HCl溶液混匀；添加10mL乙酸乙酯，超声10±2min；将容器内的所有液体转移至棕色玻璃离心管Ⅰ中，并用5mL乙酸乙酯润洗原容器内壁后将其合并至棕色离心管Ⅰ中；室温条件下以3500±500rpm转速离心；将离心所得的上层有机相通过含有无水Na2SO4的针筒后，收集至棕色玻璃离心管Ⅱ中，氮吹至乙酸乙酯完全挥发；再加入2mL乙腈从而溶解洗涤并溶解棕色玻璃离心管Ⅱ内的物质；过0.22μm有机相膜后上机测定；3)、HPLC上机检测：分别配置流动相A和流动相B，A为乙腈+1‰甲酸(V/V)；B为水+1‰甲酸(V/V)，脱气30±5min后使用；按照下表设置HPLC流动相梯度洗脱：柱温为30℃，紫外检测器分别检测254nm和280nm波段吸光度变化；通过标样确定物质出峰时间及检测下限，并通过标线换算降解产物含量，计算污染物降解途径比例。2.根据权利要求1所述的测定多环芳烃降解产物的方法，其特征是：所述步骤1)中的矿质培养基为：称取0.50gNaNO3，1.00gKH2PO4，0.02gCaCl2，0.20gMgSO4，0.50g(NH4)2SO4，1.00gNaH2PO4·H2O溶解于1L去离子水中，搅拌混匀后，调节pH至6.5。3.根据权利要求1或2所述的测...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪海珍，杨黎，楼骏，孙姗姗，陈远志，徐建明，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33