一种基于四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的电化学生物传感器件的制备与应用研究制造技术

本发明专利技术公开了一种基于四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的电化学生物传感器件的制备与应用研究。采用碳离子液体碳糊电极(CILE)为载体，将纳米四氧化三钴(Co3O4)混悬液滴涂在CILE表面，再将辣根过氧化物酶(HRP)用Nafion膜固定在电极表面，得到修饰电极Nafion/HRP/Co3O4/CILE。紫外可见吸收光谱表明HRP在Co3O4复合膜内保持原有的蛋白质二级结构。利用循环伏安法测定修饰电极在pH=3 PBS缓冲溶液的电化学行为，出现一对峰型良好的氧化还原峰，表明Co3O4对HRP的直接电子转移有良好的促进作用，非均相电子转移速率常数为0.94 s

【技术实现步骤摘要】
一种基于四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的电化学生物传感器件的制备与应用研究
本专利技术涉及生物电化学与电化学传感领域，以及电化学分析领域，尤其涉及一种四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的制备方法及其应用。
技术介绍
Co3O4，一种典型的P型半导体材料，禁带宽度为1.5eV，具有尖晶石结构。晶体的组成是氧原子以面心立方密堆积，金属离子填充在氧原子密堆积的空隙里，其中四面体的中心为Co2+；Co3+作为八面体的中心。它是一种过渡族金属氧化物，其化学性能稳定，存贮量丰富，价格低廉，且密度为石墨的3倍，Co3O4具有好的可逆的氧化还原性能、低的价格，长期使用性能稳定，耐腐蚀，另外凭借着在磁性、扩散率、电导率、化学活性以及催化等方面的特殊性能使其及其衍生物在磁性材料、催化材料、压敏陶瓷、传感器、转换器、超级电容器、锂离子电池、能源和生物医药等方面有着广泛的应用。辣根过氧化物酶(HRP)，由无色的酶蛋白和铁卟啉结合而成，是一种水溶性氧化还原型糖蛋白，广泛存在于植物中，辣根中含量最高。HRP相对分子质量约为40000，其肽链绕成一个近似于椭球形的三维宏观结构，内部的孔洞嵌着血红素。每个血红素又由4个吡咯环组成，环中间存在着电化学活性中心Fe2+/3+，所以HRP经常被选来当作研究蛋白质直接电化学和电化学传感器的模型分子。三氯乙酸(TCA)作为一种有机卤化物,稳定性强,难以在一般电极上被直接还原去卤化，它是四氯化碳的新陈代谢的副产物。它的应用非常广泛，农业方面可制备芽前除草剂、医疗美容方面可做去皱剂、纹身剂，日常生活中也被用作饮用水的消毒剂，三氯乙酸能够导致生物体内的肺肿瘤，也可以造成癌症和影响人类生殖功能。世界卫生组织明确规定水环境中三氯乙酸的安全存在量为100μg/L。
技术实现思路
鉴于上述背景，本专利技术构建了一种新型第三代电化学酶传感器件，克服了前两代酶传感器的诸多问题，制得的修饰电极对三氯乙酸还原性好，能进行电流信号的放大且获得的线性范围广，检测限低，灵敏度高，可很好应用于检测三氯乙酸在待测物中的含量。本专利技术采用的技术手段如下：所述的四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的制备方法，包括以下步骤：S1、按照质量比（1.5~2.5）:1取石墨粉与N-己基吡啶六氟磷酸盐，与液体石蜡置于研钵中研磨均匀，得到碳糊，然后将碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极CILE；S2、取4~8μLCo3O4溶液滴涂在CILE表面，室温条件下避光自然晾干，得到Co3O4/CILE电极；S3、再取6~10μL10~20mg/mLHRP溶液滴涂在Co3O4/CILE电极表面，在室温下避光自然晾干，得到HRP/Co3O4/CILE电极；S4、最后取4~6μL0.3~0.7%Nafion乙醇溶液滴涂在HRP/Co3O4/CILE电极表面，室温下避光晾干后，即得到Nafion/HRP/Co3O4/CILE电极。进一步的，所述S1步骤中，每克离子液体使用500~700μL液体石蜡。进一步的，所述S1步骤中，石墨粉与离子液体HPPF6的质量比为2:1。进一步的，所述S1步骤中，所述研磨时间为2.5h以上。进一步的，所述S1步骤中，所述玻璃电极管内径为4mm。进一步的，所述S3步骤中，HRP溶液浓度为15mg/mL。进一步的，所述S4步骤中，Nafion乙醇溶液的体积浓度为0.5%。进一步的，所述的四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的制备方法，包括以下步骤：S1、取1.6g石墨粉、0.8g离子液体HPPF6与500μL液体石蜡置于研钵中研磨均匀，得到碳糊，然后将碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极CILE；S2、取6μLCo3O4溶液滴涂在CILE表面，室温条件下避光自然晾干，得到AuNCs/CILE电极；S3、再取8μL15mg/mLMb溶液滴涂在Co3O4/CILE电极表面，在室温下避光自然晾干，得到HRP/Co3O4/CILE电极；S4、最后取6μL0.5%Nafion乙醇溶液滴涂在HRP/Co3O4/CILE电极表面，室温下避光晾干后，即得到Nafion/HRP/Co3O4/CILE电极。本专利技术任一项所述的四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的制备方法用于电催化还原三氯乙酸。本专利技术任一项所述的四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的制备方法用于检测三氯乙酸。本专利技术所述的四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的检测环境为在pH3.0的磷酸盐缓冲溶液中。本专利技术中，CILE为碳离子液体电极，Co3O4为四氧化三钴，HRP为辣根过氧化物酶，Nafion为全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物，TCA为三氯乙酸，PBS缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。附图说明图1：不同放大倍数下的Co3O4的扫描电镜图(A-C)。图2：(a)HRP和(b)HRP-Co3O4混合溶液紫外可见吸收光谱图。图3：不同修饰电极在pH3.0的PBS缓冲溶液，扫描速度100mV/s循环伏安图，其中：(a)Nafion/CILE,(b)Nafion/Co3O4/CILE,(c)Nafion/HRP/CILE和(d)Nafion/HRP/Co3O4/CILE。图4：不同修饰电极的电化学交流阻抗图谱，(a)Nafion/Co3O4/CILE,(b)Nafion/HRP/Co3O4/CILE,(c)Nafion/CILE和(d)Nafion/HRP/CILE。图5：修饰电极在不同浓度TCA存在下的循环伏安图(a到l为0.0,2.0,5.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0,60.0,70.0,80.0,90.0mmol/L)(插图：还原峰电流与TCA浓度之间的关系曲线)。图6：修饰电极对医用换肤液中TCA含量的检测的循环伏安图(a到e分别为0.0,31.48,52.30,73.15,89.55mmol/L)。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本专利技术作进一步描述，但并不因此而限制本专利技术的保护范围。实施例1扫描电镜与透射电镜图用扫描电子显微镜记录了纳米Co3O4的形貌，不同放大倍数的SEM照片如图1A-C所示。纳米Co3O4呈现出类球体形态，多个小球体粘结在一块。当放大倍数到一定程度时，Co3O4呈现出类尖晶石结构，棱角分明。实施例2紫外可见吸收光谱图紫外可见光谱法(UV-Visspectroscopy)是研究蛋白质的二级结构的常用手段，其Soret吸收带的位置迁移可以提供蛋白质的结构信息。图2是HRP溶液(曲线a)和HRP-Co3O4混合液(曲线b)的UV-Vis吸收光谱图。其Soret吸收带分别出现在403.00nm和402.50nm处，波长位置基本没有什么变化，表明HRP与纳米Co3O4混合后仍然保持原有的构像，没有发生结构变化。实施例3HRP在修饰电极上的直接电化学图3为不同修饰电极在pH3.0的PBS缓冲溶液中的循环伏安图。从图中可以看出，在Nafion/CILE(曲线a),Nafion/Co3O4/CILE(曲线b)上，没有氧化峰还原峰均，表明电极表面不存在电活性物质。在Nafion/HRP/CILE(曲线c)上出现了一对非对称的氧化还原峰，说明HRP和CILE之间的电子传输速率较慢。而在Nafion/HRP/Co3O本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的电化学生物传感器件的制备其特征在于，包括以下步骤：S1、按照质量比(1.5~2.5):1取石墨粉与离子液体N‑己基吡啶六氟磷酸盐，与液体石蜡置于研钵中研磨均匀，得到碳糊，然后将碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极CILE；S2、取4~8 μL 0.2~0.8 mg/mL Co3O4溶液滴涂在CILE表面，室温条件下避光自然晾干，得到Co3O4/CILE电极；S3、再取6~10 μL 10~20 mg/mL HRP溶液滴涂在Co3O4/CILE电极表面，在室温下避光自然晾干，得到HRP/Co3O4/CILE电极；S4、最后取4~8 μL 0.3~0.7% Nafion乙醇溶液滴涂在HRP/Co3O4/CILE电极表面，室温下避光晾干后，即得到Nafion/HRP/Co3O4/CILE电极。

【技术特征摘要】
1.一种基于四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的电化学生物传感器件的制备其特征在于，包括以下步骤：S1、按照质量比(1.5~2.5):1取石墨粉与离子液体N-己基吡啶六氟磷酸盐，与液体石蜡置于研钵中研磨均匀，得到碳糊，然后将碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极CILE；S2、取4~8μL0.2~0.8mg/mLCo3O4溶液滴涂在CILE表面，室温条件下避光自然晾干，得到Co3O4/CILE电极；S3、再取6~10μL10~20mg/mLHRP溶液滴涂在Co3O4/CILE电极表面，在室温下避光自然晾干，得到HRP/Co3O4/CILE电极；S4、最后取4~8μL0.3~0.7%Nafion乙醇溶液滴涂在HRP/Co3O4/CILE电极表面，室温下避光晾干后，即得到Nafion/HRP/Co3O4/CILE电极。2.根据权利要求1所述的四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中,每克离子液体使用500~700μL液体石蜡。3.根据权利要求1所述的四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中,所述研磨时间为2.5h以上。4.根据权利要求1所述的四氧化三钴和辣根过氧化物酶修饰电极的制备方法，其特征在于，所述S3步骤中，HRP溶液浓度为15mg/mL。5.根据权利要求1所述的四氧化三钴和辣根过氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙伟，陈玮，殷春晓，翁文举，
申请(专利权)人：海南师范大学，
类型：发明
国别省市：海南,46