一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法技术

本发明专利技术提出一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法，解决了现有技术中用近红外光谱法检测草莓品种中遇到的灵敏度差、建模难度大、准确性差的技术问题。本发明专利技术采用核磁共振技术获得不同品种草莓的NMR指纹图谱，并对指纹图谱进行分析，鉴别不同品种中的化学成分，采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS‑DA）对不同品种进行化学成分分析，在OPLS‑DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV‑ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，最终通过OPLS‑DA模型中的Score图分析不同品种的草莓。

【技术实现步骤摘要】
一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法
本专利技术涉及植物代谢组学领域，特别是指一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法。
技术介绍
代谢组学(metabonomics或metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。之后得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等与人类健康护理密切相关的领域。其样品主要是动植物的细胞和组织的提取液。主要技术手段是核磁共振（NMR），质谱（MS），色谱（HPLC，GC）及色谱质谱联用技术。核磁共振（NMR）由于其灵敏性、无损性以及能够根据特征峰定性的探测代谢物成分等优点，已发展为代谢组学中最常用的化学分析检测技术。核磁测定样品是非破坏性的，且只要很少的样品预处理，就可以获得提取物的结构信息，具有较好的重现性。草莓（学名：Fragaria×ananassaDuch.），多年生草本，蔷薇科植物草莓的果实，别名有洋莓、凤阳草莓、地莓、蚕莓、蛇莓、大草莓、红莓、士多啤梨、鸡冠果等。草莓味甘、酸，性凉，有润肺生津、健脾和胃、补血益气、凉血解毒的功效，是滋补老人、孩子和体虚者的佳品，被誉为“春季第一果”。在世界卫生组织公布的最佳水果榜上名列第二。草莓营养丰富，含有多种有效成分，营养比例比较合理。具有预防心脑血管疾病、预防贫血、抗氧化和增强免疫力、抗癌、医治失眠、美容、影响脑和智力发育、促进胃肠蠕动、帮助消化、改善便秘、治疗痔疮、解酒和解毒、清除体内的重金属离子等保健作用。草莓品质受到栽培条件、成熟季节、采收处理等多方面因素的影响，但品种的差异是决定草莓品质的主要因素。具有较高营养品质的草莓售价较高。然而，不同品种的草莓果实外观并没有十分明显的差异，因此，一些不法商贩为牟取利润，往往以次充好，欺骗消费者，使消费者的权益受损。目前，草莓品种鉴别多采用近红外光谱法（牛晓颖，光谱学与光谱分析，2012,32（8）和闫润，农业机械学报，2013,44（9）），倍频及合频吸收，灵敏度差；建模难度大，定标样品的选择、制备，精确的化学分析，基础数据的准确性以及选择计量学方法的合理性，都将直接影响最终的分析结果。
技术实现思路
本专利技术提出一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法，解决了现有技术中用近红外光谱法检测草莓品种中遇到的灵敏度差、建模难度大、准确性差的技术问题。本专利技术采用核磁共振技术获得不同品种草莓的NMR指纹图谱，并对指纹图谱进行分析，鉴别不同品种中的化学成分，采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS-DA）对不同品种进行化学成分分析，在OPLS-DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV-ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，最终通过OPLS-DA模型中的Score图分析不同品种的草莓。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法，步骤如下：S1草莓样本的制备：将草莓样品洗净后打成浆，置于液氮中研磨成草莓粉末，草莓粉末于-80℃条件下保存；S2草莓样本的前处理：称取一定量的草莓粉末，加入0.2M的磷酸缓冲溶液，混匀处理后，取上清液至5mm核磁管中测定；S3草莓样本测定的条件：将上清液置于核磁共振光谱仪上记录1HNMR谱，条件为5mm多核宽带观测探头、观测频率600.13MHz，采用标准ZG30脉冲序列采集；S4数据处理过程：利用AMIX软件对去除4.7-5.00ppm的所有在0.5-9.5ppm的1HNMR谱峰以0.04ppm的宽度进行分段积分，并对所得到的积分值进行谱积分面积总和归一化处理。所述步骤S2中的磷酸缓冲溶液，pH=7，含有0.05wt%的TSP内标。所述步骤S2中每1mg草莓粉末用20-25μL磷酸缓冲溶液溶解。所述步骤S2中混匀处理的条件为涡旋振荡5min，超声15min后，于10000rp/m离心10min。所述步骤S3中采集的条件为实验温度为300K，累加次数48次，谱宽为20ppm，采集点数为32K。所述步骤S4中利用AMIX软件(德国Bruker-Biospin公司研发)处理前先对每个NMR谱，分别采用线宽为0.25的指数窗函数进行傅立叶变换，进行相位调整和基线校正后，以TSP信号峰中心位置δ0.00进行化学位移定标。S5数据分析：所获得的不同品种草莓的NMR指纹图谱，利用肉眼并不能有效的区别出各品种，如图1所示。本技术方案能产生的有益效果：1、本专利技术建立了草莓样本的制备，化学物质的提取、测定、识别，不同品种间化学成分代谢组学分析，本专利技术采用核磁共振技术获得不同品种草莓的NMR指纹图谱，并对指纹图谱进行分析，鉴别不同品种中的化学成分，采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS-DA）对不同品种进行化学成分分析，在OPLS-DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV-ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，最终通过OPLS-DA模型中的Score图分析不同品种的草莓，本专利技术与传统的近红外光谱鉴别方法相比较，操作简单快速，不需要建模，灵敏度高，结果准确可靠。2、本专利技术与传统的近红外光谱鉴别方法相比较，操作简单快速，不需要建模，灵敏度高，结果准确可靠。3、本专利技术对PLS-DA模型进行排列验证，验证结果如图2所示，模型有效性验证显示该模型可靠、有效，可用于OPLS-DA的相关分析研究，采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS-DA）对不同品种进行分析。在OPLS-DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV-ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，如表1所示，表1三组草莓OPLS-DA模型的内部交叉验证和CV-ANOVA验证参数GroupR2XQ2p(CV)Significance三组不同品种0.9450.9633.41×10-9s.结果发现所建立的不同品种草莓模型具有统计意义，表明了所建模型有效且可靠，能够进行数据分析。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1不同品种草莓600MNMR图谱。图2为200次排列实验验证草莓样本PLS-DA模型的有效性图。图3为不同品种草莓的OPLS-DA得分图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法，包括如下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法，其特征在于，步骤如下：S1草莓样本的制备：将草莓样品洗净后打成浆，置于液氮中研磨成草莓粉末，草莓粉末于‑80℃条件下保存；S2草莓样本的前处理：称取一定量的草莓粉末，加入0.2M的磷酸缓冲溶液，混匀处理后，取上清液至 5 mm核磁管中测定；S3草莓样本测定的条件：将上清液置于核磁共振光谱仪上记录

【技术特征摘要】
1.一种基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法，其特征在于，步骤如下：S1草莓样本的制备：将草莓样品洗净后打成浆，置于液氮中研磨成草莓粉末，草莓粉末于-80℃条件下保存；S2草莓样本的前处理：称取一定量的草莓粉末，加入0.2M的磷酸缓冲溶液，混匀处理后，取上清液至5mm核磁管中测定；S3草莓样本测定的条件：将上清液置于核磁共振光谱仪上记录1HNMR谱，条件为5mm多核宽带观测探头、观测频率600.13MHz，采用标准ZG30脉冲序列采集；S4数据处理过程：利用AMIX软件对去除4.7-5.00ppm的所有在0.5-9.5ppm的1HNMR谱峰以0.04ppm的宽度进行分段积分，并对所得到的积分值进行谱积分面积总和归一化处理。2.如权利要求1所述的基于NMR代谢组学技术鉴别草莓品种的方法，其特征在于：所述步骤S2中的磷酸缓冲溶液，pH=7，含有0.05w...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴绪金，安莉，汪红，马婧玮，吴家锴，张军锋，李通，周娟，李萌，马欢，杨国华，
申请(专利权)人：河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41