一种基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法，属于中药材鉴定技术领域。本方法将三叶木通茎切细段浸泡于乙醇中，采用铬酸硝酸混合液40度温箱处理；将处理材料用水清洗、离心后取其沉淀物乙醇中保存，经番红溶液染色，在SEM(扫描电子显微镜)下对管状分子穿孔板类型、纹孔膜特征、口径长度进行统计，本发明专利技术方法能够快速、准确的鉴别出木通科的三叶木通与毛茛科的川木通、马兜铃科的关木通，该方法的意义在于能够在此基础上建立常用木通药材微形态学鉴定的指导性标准。

【技术实现步骤摘要】
一种基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法
本专利技术属于中药材鉴定
，涉及三叶木通及其易混淆品种的鉴定方法，具体涉及一种基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法。
技术介绍
中药木通来源于木通科木通属植物三叶木通和白木通的根、茎，具有活血止痛、清热利尿的功能。传统中药木通又称木通，收载于《中国药典》。但在用药历史上，由于木通资源紧缺，该属植物属历史性混用，曾出现木通混用现象，有马兜铃科的关木通、毛茛科的川木通，其中马兜铃科的关木通危害最大，会导致严重的肾功能衰竭、尿毒症，严重危及患者的健康和生命，我国在2003年就明令禁止使用关木通。其它代用如马兜铃科的大叶马兜铃、淮通马兜铃以及毛茛科小木通和绣球藤由于危害较轻，并未引起足够重视。对于混用的原因，主要是由于：1.资源紧缺；2.基础研究薄弱(不认识、分类乱、成分不清楚)。因此，对传统中药木通进行全面细致的生物学分析迫在眉睫，有望彻底解决历史遗留性混用和代用问题。木通传统的鉴定方法主要是根据其茎的形态(如断面粗糙特征，导管直径)和粉末颜色(棕色)(中华人民共和国药典，2010版)，但是由于没有详细而客观的标准，导致鉴定不准确或错误。近年来较新的鉴定方法如DNA条形码、分子标记、色谱法等方法来鉴定，DNA条形码和分子标记法费用高、周期长、数据分析复杂，增加了鉴定的难度和成本。色谱法由于不同地域、不同生长期以及不同器官的有效药用成分存在差异，比较和筛选难以确定统一的标准。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法，该方法快速、精准，对设备要求低，操作容易。本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术公开的一种基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法，包括以下步骤：1)将待鉴别的药材木通藤茎切细段浸泡于乙醇溶液中进行固定，然后采用铬酸-硝酸离析法进行离析处理；2)将经步骤1)处理后的药材洗涤、离心，取沉淀物，将沉淀物浸没于乙醇溶液中制成悬浮液，保存备用；3)制备临时装片；4)将经步骤3)制好的临时装片染色处理后，在SEM下观察，并拍照记录药材的管状分子穿孔板类型、纹孔膜特征、导管纹孔试样及口径长度；5)当观察结果满足：第一，95％以上的导管端壁为单穿孔板类型，5％的为梯状穿孔板，端壁穿孔板具有短喙；第二，若侧壁穿孔板为梯状，其端壁为单穿孔平截无尾；第三，纹孔膜仅出现在管胞状导管的端壁；第四，导管的纹孔式样为互列式；第五，口径长度为30～60μm；则判断该药材为三叶木通。优选地，步骤1)中，所述固定是将木通藤茎切成长度为0.8～2cm的小段，浸入浓度为70％的乙醇溶液中固定40～60h。优选地，步骤1)中，所述离析处理是将固定后的材料浸入离析液中，在40～50℃的恒温箱中离析处理24～48h。优选地，所述离析液由质量浓度为10％的硝酸溶液和质量浓度为10％的铬酸溶液等体积混合配制而成；加入的离析液的质量为材料的15～20倍。优选地，步骤2)中，洗涤是用蒸馏水洗涤；离心是在6000～8000rpm下处理8～12min。优选地，步骤2)中，将离心后的沉淀物浸没于质量分数为50％的乙醇溶液中。优选地，步骤2)中，制得的悬浮液保存时间长达6个月。优选地，步骤3)中，临时装片是吸取1～2滴悬浮液滴于洁净的载玻片上，滴入蒸馏水涂抹均匀，盖上盖玻片，阴干48h。优选地，步骤4)中，采用5％的番红溶液进行染色。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术利用扫描电镜(SEM)技术，根据不同物种的药材藤茎的导管分子微特征，如纹孔膜，纹孔式样，穿孔板类型，不同穿孔板的导管分子比例等，来精准鉴别药材。三叶木通茎的显微特征为：(1)95％的导管多为单穿孔板类型，且端壁穿孔板具有短喙，仅5％的类型为梯状穿孔板；(2)无纹孔膜，或仅出现在管胞状细长导管的端壁；(3)导管侧壁的穿孔板为梯状、纹孔式样为互列式；(4)导管大小长度约100-300μm、口径约30-60μm。本专利技术方法能够快速、准确的鉴别出木通科的三叶木通与毛茛科的川木通、马兜铃科的关木通，该方法的意义在于能够在此基础上建立常用木通药材微形态学鉴定的指导性标准。附图说明图1-8为三叶木通不同大小的导管的扫描电镜照片。图1为50*350μm；图2为50*550μm；图3为管胞式导管，10*220μm；图4为50*340μm；图5为45*180μm；图6为10*170μm；图7为38*200μm；图8为43*120μm；图9-12为三叶木通不同的穿孔板。图9为单穿孔板；图10为管胞状导管的单穿孔板；图11为具长喙的单穿孔板；图12为梯状穿孔板.图13-15为侧壁穿孔板、纹孔类型。图13示管胞式导管的纹孔膜丰富；图14为侧壁梯状穿孔板；图15为互列式纹孔式样。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。实施例基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法，包括以下步骤：1、藤茎的固定：取木通藤茎，用刀片切成长约1cm、火柴棒大小的小段放入小玻璃瓶中，70％乙醇固定48小时。2.离析材料的制备：用铬酸-硝酸离析法，在玻璃瓶中加入10％硝酸和10％铬酸等量混合配成的离析液，用量为材料的20倍，放入约40℃的恒温箱中进行离析，约24-48小时。3.离析材料的清洗和收集：离析完毕，倒出离析液。将材料加入50mL离心管中，加入蒸馏水约30mL，水平离心10分钟，速度6000-8000rpm，弃上清，重复洗涤两次。4.悬浮液的制备：将收集的材料放置在玻璃小瓶中，加入5倍的50％乙醇保存。5.样品制备：用滴管吸取1-2滴混合悬浮液置于干净的载玻片上，滴入蒸馏水，涂抹均匀，盖上盖玻片，制作临时装片，阴干48小时以上。6.扫描电子显微镜观察统计：将盖玻片取下，材料面朝上粘贴在样品台上，喷金，观察导管分子的微特征并拍照。7、当观察结果满足：第一，95％以上的导管端壁为单穿孔板类型，5％的为梯状穿孔板，端壁穿孔板具有短喙；第二，若侧壁穿孔板为梯状，其端壁为单穿孔平截无尾；第三，纹孔膜仅出现在管胞状导管的端壁；第四，导管的纹孔式样为互列式；第五，口径长度为30～60μm；则判断该药材为三叶木通。为了验证本专利技术方法的有效性，选取三叶木通和其易混淆的关木通及川木通按照本专利技术公开的方向进行鉴定，三叶木通与易混淆植物在SEM下管状分子的微特征区别如下表1所示：表1注.“+”代表有此特征,“-”代表无此特征由上表可见，三叶木通茎的显微特征为：(1)95％的导管多为单穿孔板类型，5％的具有梯状穿孔板，端壁穿孔板具有短喙；(2)若侧壁穿孔板为梯状，其端壁为单穿孔平截无尾；(3)纹孔膜仅出现在管胞状导管的端壁；(4)导管的纹孔式样为互列式；(5)口径约30-60微米。而关木通的端壁和侧壁穿孔板均为单穿孔板、纹孔膜发达、导管端壁的尾不明显，川木通则具有网状穿孔板、梯-单、网-梯穿孔板等复杂的混合类型，以及少数单穿孔板，纹孔膜丰富。同时，为了验证三叶木通导管的特征，测量和统计其藤茎的管状分子大小和类型，运用扫描电镜照片分析表明：1)管状分子大小(参见图1-8)，口径平均为37μm，最小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将待鉴别的药材木通藤茎切细段浸泡于乙醇溶液中进行固定，然后采用铬酸‑硝酸离析法进行离析处理；2)将经步骤1)处理后的药材洗涤、离心，取沉淀物，将沉淀物浸没于乙醇溶液中制成悬浮液，保存备用；3)制备临时装片；4)将经步骤3)制好的临时装片染色处理后，在SEM下观察，并拍照记录药材的管状分子穿孔板类型、纹孔膜特征、导管纹孔试样及口径长度；5)当观察结果满足：第一，95％以上的导管端壁为单穿孔板类型，5％的为梯状穿孔板，端壁穿孔板具有短喙；第二，若侧壁穿孔板为梯状，其端壁为单穿孔平截无尾；第三，纹孔膜仅出现在管胞状导管的端壁；第四，导管的纹孔式样为互列式；第五，口径长度为30～60μm；则判断该药材为三叶木通。

【技术特征摘要】
1.一种基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将待鉴别的药材木通藤茎切细段浸泡于乙醇溶液中进行固定，然后采用铬酸-硝酸离析法进行离析处理；2)将经步骤1)处理后的药材洗涤、离心，取沉淀物，将沉淀物浸没于乙醇溶液中制成悬浮液，保存备用；3)制备临时装片；4)将经步骤3)制好的临时装片染色处理后，在SEM下观察，并拍照记录药材的管状分子穿孔板类型、纹孔膜特征、导管纹孔试样及口径长度；5)当观察结果满足：第一，95％以上的导管端壁为单穿孔板类型，5％的为梯状穿孔板，端壁穿孔板具有短喙；第二，若侧壁穿孔板为梯状，其端壁为单穿孔平截无尾；第三，纹孔膜仅出现在管胞状导管的端壁；第四，导管的纹孔式样为互列式；第五，口径长度为30～60μm；则判断该药材为三叶木通。2.根据权利要求1所述的基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，所述固定是将木通藤茎切成长度为0.8～2cm的小段，浸入浓度为70％的乙醇溶液中固定40～60h。3.根据权利要求1所述的基于SEM下管状分子特征的三叶木通易混淆品种的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，所述离析处理是将固定后的材料浸入离析液中，在4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小卉，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61