一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法，所述试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜上喷涂有偶联氟虫腈的载体蛋白作为检测线，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗体或SPA印制的质控线。本发明专利技术试纸条以竞争模式为基础制备而成，样品及检测线上的靶标物竞争结合表面增强拉曼胶体金标记抗体。试验表明，本试纸具有较强的特异性和较高的灵敏度，目测检测限为ng级；拉曼仪定量检测检测限为pg级。与其他农药或兽药无交叉反应。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法
本专利技术涉及一种快速检测微量杀虫剂药物的器具，特别是涉及一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法。
技术介绍
氟虫腈，商品名称锐劲特，英文通用名称芬普尼(fipronil)，化学名称(RS)-5-氨基-1-(2,6-二氯-a,a,a-三氟-对-甲苯基)-4-三氟甲基亚磺酰基吡唑-3-腈，分子式为C8N2Cl4，分子式C12H4Cl2F6N4OS，分子量437.2，是法国罗纳普朗克公司1981年开发的苯基吡唑类杀虫剂。从上世纪90年代中期开始使用，是一种世界范围内应用广泛的广谱杀虫剂和兽药，主要用于农作物害虫控制，家庭宠物寄生虫的治疗与控制，公共卫生娱乐场所害虫防控等各方面的得到广泛应用。它通过与γ-氨基丁酸受体结合，有效抑制昆虫中枢神经系统中γ-氨基丁酸调节的氯离子通道，并且与这个通道有很高的亲和力，从而干扰虫体中枢神经系统，导致其神经及肌肉兴奋过度兴奋而死亡。大量的试验结果表明不同浓度的氟虫腈悬浮溶液、粉剂或颗粒剂通过叶面喷雾、种子包衣、拌土撒施等方式对水稻害虫如螟虫、褐飞虱、灰飞虱及稻水象甲作用效果良好。对牧场蝗虫防止效果也特别好，防治率达73％以上。对蚊子，草地红火蚁也有特别好的防治效果。氟虫腈本身对哺乳动物γ-氨基丁酸调节的氯离子通道亲和力相对较低，因此认为对哺乳动物安全性比较高。然而随着研究的深入，氟虫腈的负面影响逐渐显现，氟虫腈在机体内被代谢成很多代谢产物包括砜化物、亚砜化合物、硫化物，脱亚磺酰基化合物，实际上氟虫腈的这些主要代谢产物对哺乳动物γ-氨基丁酸调节的氯离子通道亲和力更强，并产生有害效应，已有的试验结果证明，代谢物砜化物对鸟类、脊椎动物动物的毒性均比氟虫腈本身的毒性更高，脱亚磺酰基化合物也有同样的表现。这些代谢产物通过吸收、代谢、排泄、水解及光解作用，广泛分布于动物的各个组织中，主要作用于含高脂肪器官，特别是脂肪组织、肾上腺及肝脏，以及其他组织如甲状腺，肾脏，损害动物繁殖性能，且作用持久，并通过富集作用，沉积在组织中，通过食物链危害人体健康，导致人呕吐，焦虑不安，癫痫等可见的症状。其对环境、生态系统及人类健康的影响愈来愈受到人们的普遍关注。欧盟委员会还是从2013年限制了氟虫腈的使用范围。联合国粮农组织和世界卫生组织对粮油、蔬菜、水果和动物产品中氟虫腈含量做了最高残留限量，其中牛奶、牛肾及禽蛋为0.02mg/kg，牛肝0.1mg/kg，牛肉0.5mg/kg，禽肉为0.01mg/kg。我国GB2763也对粮油、蔬菜、水果、糖料及食用菌残留限量做了规定，除了(鲜食)玉米为0.1mg/kg外，其他皆为0.02mg/kg。目前国内外检测氟虫腈残留的方法主要采用理化分析方法，主要是色谱法，包括液相色谱法-串联质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱法(GC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱质谱联法(GC-MS)等，这些方法检测氟虫腈需经一系列复杂的前处理净化过程，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间，同时需要大型专门的仪器设备和专业技术人员操作，不能满足需求快速检测需求，时效性较差。氟虫腈免疫试剂盒测法，分析过程相对简单，但由于氟虫腈检测限要求比较低，因此对抗体灵敏度要求比较高，有些抗体可能达不到要求。表面增强拉曼免疫检测，具有拉曼的高灵敏度特点，也具有抗体特异性强的优点，对氟虫腈的筛查有独特优势，但目前氟虫腈免疫检测方法虽有报道，但比较少，试纸快速检测方法在国内尚属空白，亟待研究解决。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高的快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜上喷涂有偶联氟虫腈的载体蛋白作为检测线，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗体或SPA印制的质控线。所述表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层中的标记抗体为表面增强拉曼胶体金标记的抗氟虫腈单克隆抗体或多克隆抗体。在吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧0.3-0.7cm处印制有样品标记线。所述的偶联氟虫腈的载体蛋白的制备方法为，先利用水解法对氟虫腈进行结构改造：在强碱条件下，将氟虫腈中的氰基水解为羧基，得到CNT-COOH；再将CNT-COOH与BSA或OVA偶联，得到偶联氟虫腈载体蛋白的溶液。所述的偶联氟虫腈的载体蛋白的制备方法具体为：(1)将20mg氟虫腈标品溶于100μL丙酮中，搅拌下将氟虫腈的丙酮溶液逐滴加入到3mL0.1M的NaOH溶液中，60℃水浴反应24h，此时反应液由浑浊逐渐变为浅黄色澄清溶液，冷却至室温，然后在冰浴条件下，用0.1M盐酸调节反应液pH值为5，此时有浅黄色固体析出，减压抽滤，单蒸水洗涤，干燥，得到产物，命名为CNT-COOH；(2)称取5mgCNT-COOH，溶于500μL二甲基甲酰胺中，搅拌下依次加入2.5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.5mgN-羟基琥珀酰亚胺，室温反应0.5h，使CNT-COOH活化；(3)称取4.5mgBSA和5mgOVA分别溶于1mL磷酸盐缓冲液中，将250μL活化后的CNT-COOH溶液分别逐滴加入BSA和OVA的溶液中，搅拌下室温反应4h；用PBS透析3d，离心，收集上清，弃沉淀，即得到偶联氟虫腈的载体蛋白溶液，分装后保存于-20℃备用。所述的PBS透析期间多次换透析液，6-8次/天。所述的离心的转速为5000r/min，时间为5min。一种试纸条的制备方法，包括以下步骤：(1)偶联氟虫腈载体蛋白的制备(2)抗氟虫腈单克隆抗体或多克隆抗体的制备；(3)氟虫腈表面增强拉曼胶体金标记抗体的制备；(4)羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体的制备；(5)用所得的氟虫腈载体蛋白偶联物在纤维素膜层上制成检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体或SPA在纤维素膜层上制备质控线；氟虫腈表面增强拉曼胶体金标记抗体用于制备表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层，然后依次安装支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。本专利技术的检测原理为：表面增强拉曼胶体金免疫层析试纸试验的原理是采用柠檬酸三钠还原HAuCl4聚合成金颗粒，由于金颗粒之间的静电作用和布朗运动，使其保持水溶胶状态，胶体金富含电子和强大的给电子能力。拉曼活性物质4-氨基苯硫酚(PATP)及氟虫腈抗体双标记胶体金纳米颗粒制备免疫探针。把拉曼信号的高灵敏性与免疫检测的高特异性相结合，建立了表面增强拉曼免疫检测方法。胶体金以非共价键分别与PATP及氟虫腈抗体结合形成表面增强拉曼金标记抗体(PATP-Au-Ab)，将表面增强拉曼胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉上，一端与固定有氟虫腈-蛋白质偶连物(检测线)和二抗(或SPA)(质控线)的硝酸纤维素(NC)膜相连，另一端与吸附纤维层相连。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，其特征是：吸附层从测试端依次为吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜上喷涂有偶联氟虫腈的载体蛋白作为检测线，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗体或SPA印制的质控线。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，其特征是：吸附层从测试端依次为吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜上喷涂有偶联氟虫腈的载体蛋白作为检测线，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗体或SPA印制的质控线。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层中的标记抗体为表面增强拉曼胶体金标记的抗氟虫腈单克隆抗体或多克隆抗体。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：在吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧0.3-0.7cm处印制有样品标记线。4.根据权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征是：所述的偶联氟虫腈的载体蛋白的制备方法为，先利用水解法对氟虫腈进行结构改造：在强碱条件下，将氟虫腈中的氰基水解为羧基，得到CNT-COOH；再将CNT-COOH与BSA或OVA偶联，得到偶联氟虫腈载体蛋白的溶液。5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征是：所述的偶联氟虫腈的载体蛋白的制备方法具体为：(1)将20mg氟虫腈标品溶于100μL丙酮中，搅拌下将氟虫腈的丙酮溶液逐滴加入到3mL0.1M的NaOH溶液中，60℃水浴反应24h，此时反应液由浑浊逐渐变为浅黄色澄清溶液，冷却至室温，然后在冰浴条件下，用0...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡骁飞，邓瑞广，魏凤仙，王方雨，杨艳艳，孙亚宁，姚静静，邢广旭，柴书军，杨继飞，邢云瑞，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41