基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法，旨在提供一种方便、快速、高灵敏度、低成本的细菌表面增强拉曼散射(SERS)检测新技术。该方法的核心在于利用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒快速捕获尿溶液中的细菌，通过外加磁场分离、富集出细菌/金壳磁性纳米颗粒复合物，并通过滴加适配体修饰的纳米金标签材料，来实现尿液中细菌的快速检测。本发明专利技术制备的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒细菌的捕获效率高，适用范围广，磁响应能力强，可以快速有效的捕获尿液体系中的细菌。本发明专利技术采用的适配体修饰的纳米金材料，检测大肠杆菌的检测限达到10

【技术实现步骤摘要】
基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法
本专利技术属于生物与生化光谱分析领域，涉及一种表面增强拉曼散射检测中细菌的通用方法，具体涉及一种用于细菌捕获、检测的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备及其与金核银壳纳米颗粒联用协同增强细菌拉曼信号的检测方法。
技术介绍
病原菌一直以来都是人类健康的重大威胁。越早的实现细菌感染的准确诊断，患者的存活率越高。因此，准确、快速、高灵敏的鉴别、检测致病菌是防治细菌感染的关键。目前，临床医生常用的检测方法主要是传统的细菌分离培养法，但该方法耗时长，操作繁琐。新兴的一些基于分子检测的方法如核酸测序、酶联免疫吸附测定或者聚合酶链式反应等需要昂贵的仪器、成本高、检测目标单一。表面增强拉曼散射(Surface-EnhancedRamanScattering，以下简称SERS)是一种具有强大的振动光谱技术，可以对金、银等贵金属表面的物质进行无损和超灵敏检测，目前已被证明可用于细菌的指纹谱鉴定(参见BiosensorsandBioelectronics94(2017)131–140)。SERS在检测细菌方面具有灵敏度高、快速、无损、无需样品处理等优点，但主要缺点是抗干扰能力较差，容易受到实际样品中杂质的干扰。为了解决这一问题，研究人员开始使用生物识别分子修饰的SERS基底从溶液中捕获出细菌后再进行检测。万古霉素被证明是一种有效、广谱的细菌识别分子，可与细菌细胞壁作用形成牢固的氢键，既可以作用于革兰阳性菌也可以捕获革兰阴性菌。如2011年中国台湾地区科学家王玉麟教授将万古霉素修饰在商业化的SERS固体基底上实现了血液中细菌的捕获检测(参见NatureCommunications.2011；2:538)。但目前报道的方法中，万古霉素都修饰在制备方法复杂的固态SERS基底上。固态SERS基底在溶液中捕获细菌的效率较低，而且价格昂贵，不适合广泛使用。液态磁性SERS基底以磁珠为核心，表面包覆一层金/银壳的SERS增强材料，特别适用于溶液中目标物质的捕获、富集与增强。目前，现有技术中尚无关于利用万古霉素修饰的磁性SERS基底快速检测尿液环境中细菌指纹谱的详细报道。目前基于SERS检测病原菌的方法可以分为直接获取细菌的拉曼指纹信号(label-free)和通过拉曼标签(tags)标记后间接检测细菌两大类(参见Analyst,2013.138(10):p.3005-12)。前一种方法利用SERS直接获得细菌的分子特征谱图并进行分析检测。而标记法是将细菌与一个具有很强拉曼信号的标签通过免疫或杂交等方法相连，并通过间接检测标签的信号来实现生物传感的方法(参见ChemRev,2013.113(3):p.1391-428)。SERS标签指的是可提供良好SERS信号并易于修饰到目标物上的一些材料。这种SERS标签常以纳米级的金银颗粒作为增强基底，表面修饰上提供SERS信号的染料分子，以及可以跟菌体结合的生物识别分子(抗体、适配体等)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备方法，以及一种纳米金标签材料的制备方法，并基于这两种材料的联用实现尿液中细菌的快速捕获及SERS检测。本专利技术利用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒快速捕获尿液中的细菌，清洗除去杂质后，再向用磁富集的金壳磁性纳米颗粒/细菌复合物中加入纳米金标签材料，后者的适配体可特异性识别细菌，且材料中的拉曼分子可表达拉曼信号。万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒既作为高效捕获细菌的工具，又作为表面增强拉曼光谱基底材料。细菌的SERS信号不是直接来源于细菌，而是来源于纳米金标签材料标记的拉曼信号分子。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：利用11-巯基十一烷酸对制备的金壳磁性纳米颗粒进行羧基化，并作为连接臂用于万古霉素的高效偶联。万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒既作为细菌快速捕获的工具，又可以联合滴加的适配体修饰的纳米金材料，可特异性识别细菌并发出拉曼信号，实现细菌的快速、高效SERS检测。本专利技术第一方面提供一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒，是以粒径100-1000纳米磁性纳米颗粒为核心，在表面修饰PEI(即聚乙烯亚胺)后吸附一层密集均一的金种子，并利用盐酸羟胺还原作用使得吸附的金种子生长至连续的金壳，再以此金壳磁性纳米颗粒(Fe3O4@Au)为核心通过氨基化反应表面修饰11-巯基十一烷酸(MUA)作为连接臂，然后通过酰胺反应高效偶联上一层万古霉素。进一步地，所述11-巯基十一烷酸(MUA)与金壳磁性纳米颗粒(Fe3O4@Au)和万古霉素之间通过共价连接。所述金壳的厚度为1-90纳米；和/或，所述11-巯基十一烷酸的浓度范围为0.01-100mM。本专利技术第二方面提供一种如上述万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：1)通过溶剂热合成法合成粒径100-1000纳米的Fe3O4磁性纳米颗粒，并通过氨基化修饰使Fe3O4磁性纳米颗粒带上强正电。具体地，Fe3O4磁性纳米颗粒的氨基化是将适量Fe3O4磁性纳米颗粒(例如0.01-100g，优选0.1g)加入到适量聚乙烯亚胺(即PEI)溶液(例如0.09-9000mL，优选100mL)中，超声(一般至少30分钟)，使得聚乙烯亚胺自主装在Fe3O4磁性纳米颗粒表面，从而实现氨基化。2)使步骤1)制备的氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒外吸附上一层密集的微小金纳米颗粒，并加入盐酸羟胺作为还原剂，以氯金酸为原料，制备出金壳磁性纳米颗粒(即Fe3O4@Au)。优选地，所述微小金纳米颗粒的粒径为3-5纳米。优选地，所述盐酸羟胺溶液浓度为0.05-100mg/mL，更优选为0.5mg/mL。3)将步骤2)制备的金壳磁性纳米颗粒与11-巯基十一烷酸(MUA)混合，超声反应(一般1小时以上)，形成羧基化的金壳磁性纳米颗粒(即Fe3O4@Au-MUA)。优选地，所述11-巯基十一烷酸浓度为10-100微摩尔/升，更优选为50微摩尔/升。4)将步骤3)制备的羧基化的金壳磁性纳米颗粒加入到适量(例如10mL)2-(N-吗啡啉)乙磺酸(即MES)缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(即EDC)和万古霉素，超声反应(一般1小时以上)，即得万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒(即Fe3O4@Au-Van)。优选地，所述MES缓冲液pH值为5-6，浓度为0.1M。优选地，以g/mL计，所述羧基化的金壳磁性纳米颗粒与所述MES缓冲液的质量体积比为(1:10)-(1:500)，更优选为1:100。优选地，所述EDC和万古霉素使用浓度为1mg/mL。本专利技术第三方面提供一种纳米金标签材料的制备方法，包括如下步骤：1)在100-1000mL(例如100mL)水中加入0.5-5mL(例如1mL)的1％HAuCl4溶液，并加热煮沸；2)在步骤1)煮沸的溶液中加入0.5-5mL(例如1.5mL)1％(质量分数)柠檬酸钠；3)将步骤2)的混合溶液持续加热至颜色稳定；4)将步骤3)的所得混合溶液加水定容(例如定容至100mL)，制得纳米金；5)用将步骤4)中所得溶液离心(一般1000-9000rpm，离心1-15min)，弃上清后，用0.1-100mM的MES溶液重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒，其是以粒径100‑1000纳米的磁性纳米颗粒为核心，在表面修饰PEI后吸附一层密集均一的金种子，并利用盐酸羟胺还原作用使得吸附的金种子生长至连续的金壳，再将此金壳磁性纳米颗粒为核心通过氨基化反应使表面修饰11‑巯基十一烷酸作为连接臂，然后通过酰胺反应连接臂上偶联上一层万古霉素。

【技术特征摘要】
1.一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒，其是以粒径100-1000纳米的磁性纳米颗粒为核心，在表面修饰PEI后吸附一层密集均一的金种子，并利用盐酸羟胺还原作用使得吸附的金种子生长至连续的金壳，再将此金壳磁性纳米颗粒为核心通过氨基化反应使表面修饰11-巯基十一烷酸作为连接臂，然后通过酰胺反应连接臂上偶联上一层万古霉素。2.根据权利要求1所述的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒，其特征在于，所述金壳的厚度为1-90纳米；和/或，所述11-巯基十一烷酸的浓度范围为0.01-100mM。3.一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)通过溶剂热合成法合成粒径100-1000纳米的Fe3O4磁性纳米颗粒，并通过氨基化修饰使Fe3O4磁性纳米颗粒带上强正电；2)使步骤1)制备的氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒外吸附上一层密集的微小金纳米颗粒，并加入盐酸羟胺作为还原剂，以氯金酸为原料，制备出金壳磁性纳米颗粒；3)将步骤2)制备的金壳磁性纳米颗粒与11-巯基十一烷酸混合，超声反应，形成羧基化的金壳磁性纳米颗粒；4)将步骤3)制备的羧基化的金壳磁性纳米颗粒加入到适量2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和万古霉素，超声反应，即得万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，Fe3O4磁性纳米颗粒的氨基化是将适量Fe3O4磁性纳米颗粒加入到适量聚乙烯亚胺溶液中，超声，使得聚乙烯亚胺自主装在Fe3O4磁性纳米颗粒表面，从而实现氨基化；和/或，步骤2)中，所述微小金纳米颗粒的粒径为3-5纳米；和/或，所述盐酸羟胺溶液浓度为0.05-100mg/mL，更优选为0.5mg/mL；和/或，步骤3)中，所述11-巯基十一烷酸浓度为10-100微摩尔/升，更优选为50微摩尔/升；和/或，步骤4)中，所述MES缓冲液pH值为5-6，浓度为0.1M；和/或，以g/mL计，所述羧基化的金壳磁性纳米颗粒与所述MES缓冲液的质量体积比为(1:10)-(1:500)，更优选为1:100；和/或，所述EDC和万古霉素使用浓度为1mg/mL。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)通过溶剂热合成法合成粒径100-1000纳米的Fe3O4磁性纳米颗粒，并通过氨基化修饰使Fe3O4磁性纳米颗粒带上强正电；具体地，Fe3O4磁性纳米颗粒的氨基化是将0.1g的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到100mL聚乙烯亚胺溶液中，超声，使得聚乙烯亚胺自主装在Fe3O4磁性纳米颗粒表面，从而实现氨基化；2)使步骤1)制备的氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒外吸附上一层密集的微小金纳米颗粒，并加入盐酸羟胺作为还原剂，以氯金酸为原料，制备出金壳磁性纳米颗粒；所述微小金纳米颗粒的粒径为3-5纳米；所述盐酸羟胺溶液浓度为0.5mg/mL；3)将步骤2)制备的金壳磁性纳米颗粒与11-巯基十...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈香美，张楚悦，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11